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  • 2016版流式细胞仪选购指南[选购宝典]
  • 对于单个细胞及其他生物粒子的分析,流式细胞术已经成为一种不可或缺的方法。它让研究人员能够在单细胞水平高效地鉴定关键的标志物,如小分子、核酸以及肽段和蛋白。如今,仪器和试剂的创新为研究人员带来了更多的选择。如何选择一台适合的仪器?在选购中要注意些什么?赶快来看看吧。

    背景

    第一台商用的流式细胞仪是在1974年推出的。在四十多年的时间里,这台实验室主力不断进化,帮助科学家在大海中捞针,以找到细胞功能的微妙变化。仪器的流体系统、光学系统、标记技术和分析系统都在创新,但流式检测的目的并没有变:大型生物颗粒的检测和定量。

    基本组件

    市场上有各种类型的流式细胞仪,从经典的台式仪器到当下热门的便携式设备,可轻松带出实验室。所有仪器都有三个基本组件:流体系统、光学/检测系统以及分析系统。在此,我们回顾一下这些部件的基本特征,方便你选购下一台仪器。

    流体系统

    在流式分析中,细胞或颗粒溶液被聚焦成一束,以一定速度从流动室喷嘴中喷出。常见的聚焦机制是流体力学聚焦,其中细胞溶液被鞘液包裹和推动。通过调整鞘液的速度,你可以调整直径,从而调整单细胞悬液的通量;鞘液速度快,意味着细胞束窄,增加了每次只有一个细胞通过检测器的可能性。对于高通量药物筛选或T细胞免疫分型,这很有用。

    在分析更高密度的细胞时,细胞束越窄,意味着通量越低,你需要更长的时间才能获得结果。让鞘液减慢,可以提高通量。不过随之而来的是多个细胞并排通过的可能性增加,或不同细胞通过检测光束的不同部分,人工降低了某些细胞的信号。因此,在建立操作步骤时,应当优化鞘液的速度。

    声波聚焦是替代流体力学聚焦的另一种方法,它利用超声波将细胞置于单个聚焦线上。声波聚焦有助于确保每次只有一个细胞通过,同时维持比较高的通量。这种技术在寻找稀有细胞时特别有用,比如寻找血液中的循环肿瘤细胞(CTC)。赛默飞世尔的Attune NxT仪器就使用了这种声波聚焦技术。

    其他一些厂家,包括默克密理博(MUSE和Guava easCyte系统)、美天旎(MACSQuant Tyto)和Cell Signaling Technology(CellSimple)也推出了一些流式仪器,用微流体取代传统的鞘液。尽管这些仪器在功能上可能没有高端系统没有精致,但它们也带来了强大的细胞或颗粒分析。对于那些经验或经费有限的实验室而言,这些系统相当有吸引力。

     

    光学系统

    一旦细胞被聚焦成一束,它们就要接受光源(通常是激光)的拷问。光的破坏和散射,提供了有关细胞物理性质的信息。一些仪器包含多个激光光源,让用户获得更多数据。

    在许多流式系统中,光的散射以两种方式被监控。前向散射光(FSC)带来细胞大小或表面积的信息。较小的细胞折射较少的光,而较大的细胞折射较多的光。第二种是侧向散射光(SSC),它提供了细胞复杂度的信息或内部结构的检测。综合这两个测量结果,研究人员可确定多个参数和功能,从而区分不同的细胞类型。

    光散射模式只是提供了细胞的物理信息。若要拷问细胞的分子特征(如基因表达、蛋白定位或细胞周期的状态),细胞必须经过某种方式的标记。这通常使用荧光染料或荧光标记的抗体或纳米颗粒来实现的。

    最近,一些聚合物染料(如BD Biosciences的Horizon和Sirigen试剂)已经出现,它们的亮度比传统染料亮几个数量级,让研究人员能实现更精细的检测,特别适合稀有细胞。同样地,不断增加的氨基活性染料也在帮助研究人员确定和排除死细胞,从而改善分析和分选的质控能力。

    同时,纳米颗粒(如赛默飞世尔的Qdot纳米晶体)为长时间的实验带来了更加一致的荧光,因为它们不会发生光漂白,即使体外实验变成体内实验,比如干细胞移植到动物体内,它们也能被监控。

    染料、抗体和纳米颗粒的选择在很大程度上取决于应用和目标。在针对一个非常特异的细胞类型时,如CD4+ T细胞,荧光标记的抗体让你能精确定量混合物中的这些细胞。不过许多应用并不需要这么精确,比如细胞活力或细胞周期分析。在这种情况下,染料就已经绰绰有余了。

    不同的荧光基团在不同的波长下激发和发射,因此,许多流式细胞仪提供了多个光源(激光器)和发射滤光片。流式仪器中常用的激光器有:蓝色(488 nm)、黄绿色(561 nm)、红色(640 nm)、紫色(405 nm)和紫外光(355 nm)。许多厂商提供不同的滤光片,让研究人员能够实现多重检测,以监控多个标志物。这些实验的挑战在于优化荧光标记和现有的激光器,以便尽量减少光谱重叠。

    无论是散射光还是荧光,细胞的光信号都由光电倍增管(PMT)收集,将光强度转换为电子读数。在某种程度上,PMT的灵敏度决定了检测的分辨率 – 你可以检测的颗粒或亚细胞组分有多小,以及你是否能很好地区分邻近细胞的信号。

    对于某些仪器,特别是提供图像数据的仪器,PMT已被替换成CCD照相机。这些仪器不仅能提供荧光标记的强度信息,还能提供这些标记在细胞内的精确定位。对那些监控蛋白转位或细胞信号的实验而言,这特别有用。

    当然,成像流式细胞仪虽然带来更多信息,也产生了更大的文件,带来数据存储的问题,不过将数据推送到云平台,可缓解这一问题。此外,分析和处理数据的软件正在改善,变得更加用户友好,让经验有限的研究人员也能轻松使用。

    分选

    在鉴定细胞或颗粒之后,我们通常需要进一步的分析,利用新一代测序(NGS)或数字PCR(dPCR)这样的技术,或者培养细胞,用于治疗等目的。这时,流式细胞仪的分选功能就显得很重要。

    当细胞流离开检测光束时,压电传感器导致细胞流发生高频震动,断成一连串单细胞的液滴。流式细胞仪通常每秒形成1万至10万个液滴。事件检测和液滴形成之间的精确距离被称为液滴延迟。这是一个关键参数,可确保收集的液滴携带了触发事件的细胞。之前,液滴延迟的测定是一个费力的过程,需要多年的训练。不过最近,这个过程已在一些仪器(如Bio-Rad的S3e和BD Biosciences的FACSAria Fusion)上自动化。

    根据用户定义的参数,带电荷的细胞被偏转到管、板或其他类型的收集容器中。同时,不带电荷的细胞流进入废液缸。不同的流式细胞仪采用独特的方法来捕获和分选细胞,因此,最适合你的仪器通常取决于样品类型,以及你的下游应用。许多厂家都提供了可分选细胞的流式系统(见上表)。

    用户界面和分析系统

    当然,流式分析只是研究人员实现科学目标的手段之一。除非是中心实验室,你可能不希望调拨一个专门的技术人员来负责流式细胞仪的使用和维护。相反,你需要一台简单易用的仪器,只需极少培训。为了满足研究人员的需求,供应商开发出适合多个应用的检测试剂盒。

    此外,许多耗时费力的过程都已经在流式细胞仪上实现了自动化。一些仪器还带有自我清洁功能和堵塞检测系统,旨在最大限度减少停机时间。有时,你只需按一下按钮,就能完成实验设计,而仪器也提供了许多标准化的操作方案。对于那些日复一日开展相同检测的实验室而言,这种仪器可能很适合。

    同样地,仪器自带的数据分析工具、商业化的软件和免费软件也正变得更简单,更适合整个机构内的用户使用。许多软件包允许用户调整结果的显示模式(直方图或散点图),分离特定的细胞亚群(设门),改变分析参数(从前向散射 vs. 侧向散射到前向散射 vs. 荧光),或生成多孔板的热图。

    选购要点

    说了这么多,也许大家有点晕,到底要选购哪一台呢?请记住,流式细胞仪的基本组件在所有系统上都能找到。选择哪些特殊功能,这要取决于今天的应用,以及未来的应用。这里有一些小提示,可帮助你选择合适的流式系统。

    1. 功能性需求。你需要鉴定细胞,还是也需要细胞分选?有些仪器提供一种功能,而有些仪器可提供两种功能。不同的系统可实现更高水平的分离、鉴定和检测。

    2. 确定用户。谁将使用这个系统,他们的经验如何?仪器、试剂和软件开发商考虑到不同水平的用户,他们开发出各种产品,以满足各种经验层次的需求。

    3. 多重分析。多重分析的需求将影响到激光器的数量选择。同时,你也需要花时间来了解一下是否有适当的试剂(如染料和抗体)来检测你的目标。免费的在线资源Chromocyte提供了流式抗体的选择指南。

    4. 是否可升级。这个系统的组件(即激光器、检测器、滤光片和软件)是否可升级?厂商为他们的客户提供了许多入门级的选择,但研究是一个动态的过程,所以你要确保你的系统可随时改变,满足实验室的需求。

    5. 实验室大小。标准的台式仪器仍是大多数实验室的选择。不过,越来越多的便携式仪器已经由多个厂商推出,如默克密理博、BD Biosciences、Beckman Coulter、Cell Signaling Technology和美天旎等。

    6. 软件。厂商一般将软件和培训教程与他们的仪器捆绑在一起。另外,多家公司提供更详细的分析软件,如FLOWJO。研究人员也可在线获取许多数据分析工具。

    7. 价格。价格从来都是影响购买决策的首要因素。流式细胞仪的价格相差很大,这要取决于功能和组件的数量。研究人员应当考虑每次运行的总成本,以及细胞分离实验的开展频率。你应当将这个费用与在中心实验室分析样品的成本进行比较。

    结语

    尽管流式细胞仪已经出现了很多年,但是不光仪器,试剂和软件都在发展。如今的仪器更加小巧,但却不影响性能和功能。其他技术也正与流式分析相结合,比如RNA荧光原位杂交(FISH),以及质谱(Fluidigm的CyTOF)。这些进步在单细胞水平拓宽了人们对细胞的了解。过去那个只出现在中心实验室的仪器正走进更多的实验室。

    (作者:Randall C. Willis & Peter A. Fung / 生物通编译)

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