总蛋白提取试剂盒(蛋白相互作用适用(Pull-down、co-IP等))

BB-31012
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  • 50T
  • 100T
价格
  • ¥600元
  • ¥1000元
数量
产品概述 product description

贝博® BBproExtra® 总蛋白提取试剂盒提供全套试剂,适用于从各种原代或传代培养动物细胞和各种动物实体组织,如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等动物组织样品中提取总蛋白。配合其他试剂时,也可以用于植物、细菌、真菌、酵母等样品的总蛋白提取。 本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解细胞膜组份,包括细胞质膜、核膜和各种细胞器膜。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物,阻止了蛋白酶对蛋白的降解,为提取高纯度的蛋白提供了保证。 本试剂盒提取的蛋白可用于Pull-down、IP等蛋白相互作用研究,也可以用于WB、蛋白质电泳、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。 本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白,下游应用范围广,提取液裂解细胞的能力较温和,需要根据实际样本情况优化裂解时间。 本试剂盒中不含有EDTA,与金属螯和层析等下游应用兼容。 本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分,不可直接用于2D电泳,如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳,请使用贝博其他货号的试剂盒(相关产品BB-3181)。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳,用脱盐柱脱盐处理(相关产品BB-38113)。 本试剂盒按每个处理样本50 mg细胞/组织计(大约50 μl细胞沉淀体积),如果需要处理大量的细胞/组织,将提取液按细胞体积的1:10加入细胞沉淀即可。每个50T试剂盒大约可以提取2.5 g细胞/组织样本的总蛋白。根据不同的细胞类型,100 mg细胞沉淀物(107个细胞)的总蛋白质产量大约为6mg左右。

保存温度
2-8℃
注意事项
1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态,从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完!
有效期
一年
检测方法
Pull-down, co-IP, IP,
WB,ELISA,EMSA,purification等
适用样本
动物细胞/组织
产品特点
1.使用方便,从细胞,组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
2.提取过程简单方便,将蛋白提取的时间缩短至30分钟-1小时。
3.含蛋白稳定剂,提取的蛋白稳定。
4.紫外检测蛋白浓度时,背景干扰低。
5.总蛋白提取液含多种有效成分,可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白,又可结合释出的蛋白防止沉淀。
6.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解,蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64,每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性,包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
产品应用
Pull-down, co-IP, IP,
WB,ELISA,EMSA,purification等
仪器准备
1.离心机
2.振荡器
3.匀浆机/匀浆器
4.涡旋混匀器
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒
试剂准备
1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒
耗材准备
1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
使用注意事项
旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
蛋白酶抑制剂在2-8℃时是固体状态,从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
实验过程中的所有试剂须预冷;所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀,不影响使用,溶解后正常使用。
如果试剂盒不能短时间内用完,蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
下游实验如果是进行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性检测,提取液可以不加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂,注意提取过程保持低温操作,缩短离心时间。
Western Blot实验内参可以选用beta-actin、GAPDH、Tubulin。
离心机转速有相对离心力(RCF,×g)和每分钟转速(RPM,r/min)两种表示方式,有些离心机设置有RPM和×g显示切换,但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算:g=r×1.118×10-5×rpm2 (r 为有效离心半径,即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度,单位为厘米) 例如: 转速为3000rpm,有效离心半径为10 cm,则相对离心力(RCF,×g)为=10×1.118×10-5×30002=1006.2(×g)。
使用方法
细胞样本总蛋白提取:
悬浮细胞蛋白提取:
1. 提取液准备:
每500 μl冷的总蛋白提取液中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物和2 μl磷酸酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。
2. 取5×106个细胞,在4℃,2500×g条件下离心5分钟,小心吸取培养基,尽可能吸干,收集细胞。
3. 用冷PBS洗涤细胞两次,每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 每5×106 -1×107个细胞(大约50 mg细胞/50 μl细胞沉淀体积)中加入500 μl冷的总蛋白提取液,吹打混匀后,在4℃条件下振荡20-30分钟,至细胞充分裂解,无明显细胞沉淀。
5. 在4℃,12000×g条件下离心15分钟。
6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到总蛋白。
7. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

贴壁细胞蛋白提取:
1. 提取液准备:
每500 μl冷的总蛋白提取液中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物和2 μl磷酸酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。
2. 小心吸取贴壁细胞的培养液。
3. 用冷PBS洗涤细胞两次,每次洗涤后尽可能吸干PBS。
4. 加入适量冷的总蛋白提取液,振荡15-30分钟,至细胞充分裂解,用细胞刮刀刮一遍,将裂解液吸入另一干净离心管。
5. 在4℃,12000×g条件下离心15分钟。
6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管,即得到总蛋白。
7. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

组织样本总蛋白提取:
1. 提取液准备:
每500 μl冷的总蛋白提取液中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物和2 μl磷酸酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。
2. 取50-100mg组织样本,用PBS洗干净,然后用手术剪刀尽可能剪碎,加入500 μl总蛋白提取液,用组织匀浆器/匀浆机匀浆至无明显肉眼可见固体。
3. 将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中,在4℃条件下振荡10-20分钟。
4. 在4℃,10000-14000×g条件下离心15分钟。
5. 将上清吸入另一预冷的干净离心管,即得到总蛋白。
6. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

常见问题分析
1.蛋白浓度低?
处理部分组织样本时可能没有裂解完全,导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理,没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。

2.细胞裂解速度慢?
为了充分保证提取得到的蛋白的活性,提取液采用独特的保护蛋白的配方,裂解能力温和,下游应用范围广。适当延长裂解的时间即可。

3.用什么方法定量蛋白?
建议用BCA法。不适合用Bradford法,因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份,导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系,则可以用Bradford法定量。

4.提取时出现胶状沉淀?
蛋白提取液处理产物中有时会出现少量透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的特定蛋白的情况下,可以直接离心取上清进行后续实验即可;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则可以通过超声处理,300w/10秒间隔10秒,超声3分钟,随后离心取上清用于后续实验。检测一些常见的转录因子,例如NF-kappaB、p53等时,不必进行超声处理。

5.提取的蛋白具有活性吗?
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份,不破坏蛋白的结构,没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏,蛋白均保持其天然构象和活性。
参考文献
1.Keyu Luo, et al.
Multiple integrin ligands provide a highly adhesive and osteoinductive surface that improves selective cell retention technology
Acta biomaterialia 2019 (IF=6.638)

2.Bing Li, et al.
SWATH label-free proteomics analyses revealed the roles of oxidative stress and antioxidant defensing system in sclerotia formation of Polyporus umbellatus
Sci Rep. 2017 (IF=5.228)

3.Yan Li, et al.
Tat PTD-Endostatin-RGD: A novel protein with anti-angiogenesis effect in retina via eye drops
Biochimica et Biophysica Acta 2016 (IF=5.083)

4.Jie Li, et al.
Sex hormones regulate cerebral drug metabolism via brain miRNAs: down-regulation of brain CYP2D by androgens reduces the analgesic effects of tramadol
British Journal of Pharmacology 2015 (IF=5.259)

5.Pin Huan, et al.
Identification of differentially expressed proteins involved in the early larval development of the Pacific oyster Crassostrea gigas
Journal of Proteomics 2012 (IF=5.074)

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