2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。 2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。 3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

酵母

WB,IP等

1.离心机2.振荡器3.匀浆机/匀浆器4.涡旋混匀器5.移液器6.冰箱7.冰盒

1.PBS缓冲液 （pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X）） （phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS：约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl）2.蛋白定量试剂盒

1.离心管2.吸头3.一次性手套

1.预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。 2.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。 3.实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。 4.提取液D在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。 膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。 膜蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。

1. 提取液准备：每500 μl冷的酵母线粒体膜蛋白提取液D中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。【注】： 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。 蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶、磷酸酶活性等下游实验时，注意根据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。 提取液D在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。2. 酵母培养物，在4℃，1000×g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集酵母沉淀。3. 用PBS洗涤酵母两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。【注】： 在1000×g离心5分钟。4. 每100-200 μl体积或100-200 mg湿重酵母沉淀物中加入400 μl酵母线粒体提取液A，混匀后，在30℃条件下保温15分钟。【注】： 酵母数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。 由于膜蛋白含量较少，需要较多的细胞才能保证得率。在条件允许的情况下，尽可能加大细胞上样量。5. 在1000×g条件下离心5-10分钟，收集酵母沉淀。6. 酵母沉淀物中加入500μl酵母线粒体提取液B，充分混匀后。【注】： 根据酵母细胞量调整提取液用量，一般加菌体体积的2-5倍均可。 按酵母菌体体积每100 μl或100 mg湿重菌体加入250-500 μl提取液。7. 在37℃或室温条件下轻微振荡30-90分钟。【注】： 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔10分钟用移液器吹打混匀。 不同酵母样本需要的时间差异较大，根据下游细胞裂解的难易程度调整，如果下游试剂C处理后沉淀没有明显减少，需要延长此步骤处理时间。可以延长至2小时。8. 在2000×g条件下离心5-10分钟，弃上清，收集沉淀。9. 沉淀用PBS洗涤两次。离心收集沉淀。【注】： 在2000×g离心5分钟。10. 在沉淀中加入800 μl酵母线粒体提取液 C，充分混匀，然后在振荡器上振荡15-30分钟。【注】： 用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液有轻微晃动即可。 没有振荡器的话，在4℃静置，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。 试剂C处理后沉淀应减少，否则延长处理时间。11. 在4℃，500×g条件下离心5分钟，弃沉淀，收集上清。12. 将上清在4℃，1000×g条件下离心5分钟，弃沉淀，收集上清。13. 将上清在4℃，14000×g条件下离心20分钟。弃上清，留沉淀。14. 在沉淀中加入200-400 μl冷的线粒体膜蛋白提取液D，充分混匀。【注】： 提取液D在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。15. 在2-8℃条件下振荡20-40分钟。【注】： 此步骤必须在2-8℃条件振荡。 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。 没有2-8℃振荡条件也可以不振荡，置2-8℃静置，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。16. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。【注】： 此步骤必须在2-8℃条件离心。17. 将上清吸入另一干净离心管，在37℃水浴5-10分钟。18. 在37℃，1000×g力离心5分钟，此时溶液分为两层，下层是膜蛋白约为20-40 μl。【注】： 此步骤必须在37℃条件下离心。 没有37℃离心条件也可以不离心，稍微延长37℃水浴时间，至液体澄清，分层清晰。 由于两层均为无色液体，分层可能不清晰，需对着光线仔细观察。19. 小心移除上层，留下下层即为线粒体膜蛋白。20. 用50-100 μl膜蛋白溶解液E溶解下层，即得到酵母线粒体膜蛋白样品。【注】： 膜蛋白比较难溶解，不能很快溶解混匀，可以在加入溶解液后稍微吹打混匀，然后置于4℃冰箱静置至溶解。中途用移液器轻轻吹打混匀一次。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。 于4℃静置直至管底透明胶状物完全溶解。21. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。【注】： 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：BB-3401。 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

1.蛋白浓度低？酵母线粒体膜蛋白丰度极低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大酵母细胞的上样量。处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂BCD的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。 2.用什么方法定量蛋白？ 建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。 3.提取的蛋白具有活性吗？ 本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。 4.膜蛋白电泳没有条带？ 膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%-10%。有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。电泳时最好采用低电压低电流电泳。膜蛋白丰度通常较低，有条件可以尝试用银染染色。

1.Yingchao Xu et al. Cellular mechanism for the improvement of multiple stress tolerance in brewer's yeast by potassium ion supplementationInternational Journal of Food Science & Technology 2019  Lei Chen et al. Cinnamaldehyde inhibits Candida albicans growth by causing apoptosis and its treatment on vulvovaginal candidiasis and oropharyngeal candidiasisApplied Microbiology and Biotechnology 2019