2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。 2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。 3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

离心柱

酵母

 使用方便，提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。 将蛋白提取的时间缩短至30分钟-1小时。 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等

离心柱

1.离心机2.振荡器3.匀浆机/匀浆器4.涡旋混匀器5.移液器6.冰箱7.冰盒

1.PBS缓冲液 2.蛋白定量

1.离心管2.吸头3.一次性手套

1.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。 2.实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。 3.蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。 4.可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。 5.本试剂盒中提取液和蛋白酶抑制剂中均不含EDTA，根据需要可自行加入。 6.离心机转速有相对离心力（RCF，×g）和每分钟转速（RPM）两种表示方式，有些离心机设置有RPM和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：g=r×1.118×10-5×rpm2 （r 为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米) 例如: 转速为3000rpm，有效离心半径为10 cm，则相对离心力（RCF，×g）为=10×1.118×10-5×30002=1006.2（×g）。

1. 提取液制备：每500 μl蛋白提取液B中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。【注】： 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。 蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶、磷酸酶活性等下游实验时，注意根据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。2. 取酵母培养物，在4℃，1000×g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集酵母沉淀。3. 用冷PBS洗涤酵母两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。【注】： 加入PBS混匀，2000×g离心5分钟。4. 每100-200 μl体积酵母沉淀物中加入250-500 μl冷的酵母蛋白提取液A，充分混匀。【注】： 根据酵母细胞量调整提取液用量，一般加菌体体积的2-5倍均可。 按酵母菌体体积每100μl或100mg湿重菌体加入250-500 μl提取液。 若后面步骤中试剂B处理时沉淀难以裂解，应延长此步试剂A的处理时间。5. 在37℃条件下于振荡30分钟-2小时。【注】： 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。 不同酵母样本需要的时间差异较大，根据下游细胞裂解的难易程度调整，如果下游试剂B较难裂解，裂解后沉淀没有明显减少，需要延长此步骤处理时间。可以延长至2小时。6. 在4℃，2000×g条件下离心5-10分钟，弃上清，留沉淀。7. 用PBS洗涤沉淀一次。在4℃，2000×g条件下离心5-10分钟，弃上清，留沉淀。8. 在沉淀物中加入300-500 μl冷的酵母蛋白提取液B，混匀后，在2-8℃条件下振荡30-45分钟。【注】： 试剂B处理后沉淀应明显减少，否则延长处理时间。 用振荡器/摇床的较低转速保持提取液轻微晃动即可。 没有振荡器的话，在4℃静置，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。9. 套上液体收集管，将提取液吸入蛋白离心管内管中，在4℃，10000×g条件下离心5分钟。【注】： 离心前蛋白液会在重力作用下自然流穿离心柱，一定要先套上收集管再吸入蛋白液。10. 收集套管内液体即得到酵母细胞总蛋白。11. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。【注】： 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：BB-3401。 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

1.细胞裂解速度慢？ 为了充分保证提取得到的蛋白的活性，提取液采用独特的保护蛋白的配方，裂解能力温和，下游应用范围广。适当延长裂解的时间即可。 2.蛋白浓度低？ 处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A和B的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。 3.用什么方法定量蛋白？ 建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。 4.提取的蛋白具有活性吗？ 本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性

1.Qi Yan et al.Efficient substrate screening and inhibitor testing of human CYP4Z1 using permeabilized recombinant fission yeastBiochemical Pharmacology 2017  Fange Kong et al.