2-8℃

1.离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。
2.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

提取

动物细胞

1.使用方便，无需超速离心，省时省力；
2.纯度高，富集量大，应用范围广；
3.获取的囊泡结构和功能完整；
4.稳定性好，便于运输，便于保存。

根据需要使用

1.离心机
2.移液器
3.冰箱
4.冰盒

1.PBS缓冲液 （pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X）） （phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS：约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl）

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

1.不同细胞的囊泡数量差异极大，请根据实际情况选择样品的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的细胞。
2.在收获细胞时，应确定死亡细胞不超过5%。细胞凋亡/死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡，它们在囊泡的提取过程中会污染活细胞产生的囊泡。
3.已经分离好的囊泡样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。

囊泡提取：
1. 取5-10×106个细胞，在4℃，500×g力条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 细胞沉淀中加入1ml试剂D，充分混匀（每20μl体积细胞沉淀（约20mg，2×106个细胞）中加入200-300μl冷的提取液 D），高速涡旋振荡混匀或吹打混匀，置2-8℃条件振荡10-30分钟。
4. 然后在4℃，2000×g条件下离心5分钟。
5. 将上清吸入另一预冷的干净离心管。
6. 在1ml上清中加入0.25ml提取液A，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀1分钟左右，使液体充分混匀。
7. 置2-8℃冰箱静置过夜。
8. 在4℃条件下，10000×g离心60分钟。
9. 小心移除上清，收集沉淀。
10. 取500μl囊泡保存液将沉淀重悬，用移液器轻轻吹打混匀，得到囊泡沉淀重悬液，进行下列囊泡纯化步骤操作。

清洗囊泡纯化离心管：
1. 用缓冲液或纯水进行预清洗。
2. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。

囊泡纯化：
1. 将囊泡纯化离心管内管插入所提供的一个微量离心管中。
2. 向内管中加入过500 μl的囊泡沉淀重悬液样本，并盖上盖子。
3. 将盖好盖子的囊泡纯化离心管放入离心转子中，让盖子的连接带朝着转子的中央；用一个类似的离心管平衡。
4. 以5000-8000 ×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50μl-100μl液体。
5. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。
6. 为了回收纯化后的囊泡，将内管倒过来插在另一个干净的微量离心管中。放在离心机中，让打开的盖子朝着转子的中央；用一个类似的离心管进行平衡。
7. 以1000 x g离心2分钟，使纯化后的囊泡样本从纯化内管转移到收集管中。
8. 吸取收集管中的液体，即得到囊泡样品纯品。
9. 用纯水或缓冲液洗涤内管和收集管，继续纯化下一个样品。

囊泡纯化离心管清洗和保存：
1. 使用后用水冲洗干净；
2. 内管加入超纯水500µl，5000×g离心5分钟；
3. 吸净内管中的水，加入500µl 0.1M NaOH，5000g离心20分钟；
4. 用0.1M NaOH 浸泡24小时；
5. 用水冲洗干净；
6. 用无菌水浸泡2-8℃保存。
7. 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。

1.蛋白浓度低？
很多细胞囊泡量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大培养上清的上样量。
处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。请选择高质量的蛋白裂解液或蛋白提取试剂盒。

2.抽提得到的RNA浓度低？
很多细胞囊泡量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大培养上清的上样量。
 囊泡纯化管内管膜会因为离心时间过长而变干么？
不会，因为内管有死体积，总会有溶液残留在内管中。死体积大约10-20μl。

3.可以重复使用过滤管么？
可以重复使用。如果使用、清洗、保存得当，可以反复使用多次。但是超过8次重复使用后过滤膜有破损风险，注意使用过程中尽量避免尖锐物品戳到膜。离心力不要过大。