2-8℃

离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。 试剂拆封后请尽快使用完！

一年

提取

动物细胞

1.使用方便，无需超速离心，省时省力； 2.纯度高，富集量大，应用范围广； 3.获取的囊泡结构和功能完整； 4.稳定性好，便于运输，便于保存。

根据需要使用

1.离心机2.移液器3.冰箱4.冰盒

1.PBS缓冲液 2.纯水

1.离心管2.吸头3.一次性手套

 不同细胞的囊泡数量差异极大，请根据实际情况选择样品的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的细胞。 在收获细胞时，应确定死亡细胞不超过5%。细胞凋亡/死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡，它们在囊泡的提取过程中会污染活细胞产生的囊泡。 已经分离好的囊泡样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。

1. 取5-10×106个细胞，在4℃，500×g力条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。3. 细胞沉淀中加入500 μl-1 ml试剂A，充分混匀（每20 μl体积细胞沉淀（约20 mg，2×106个细胞）中加入200-300 μl冷的提取液 A），振荡混匀或吹打混匀，置2-8℃条件振荡10-30分钟。4. 然后在4℃，2000×g条件下离心10分钟。弃沉淀，收集上清。5. 将上清吸入另一预冷的干净离心管。6. 在4℃条件下，3000×g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。7. 将上清吸入另一预冷的干净离心管。得到囊泡粗提液。8. 将囊泡粗提液进行下列囊泡纯化步骤操作。 清洗囊泡纯化离心管： 1. 用缓冲液或纯水进行预清洗。 2. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。 【注】： 可以在囊泡提取步骤中需要使用前再清洗。 重复使用时要仔细检查管壁上有没有裂纹。 囊泡纯化： 1. 将囊泡纯化离心管内管插入所提供的一个微量离心管中。 2. 向内管中加入过500 μl的囊泡粗提液样本，并盖上盖子。 3. 将盖好盖子的囊泡纯化离心管放入离心转子中，让盖子的连接带朝着转子的中央；用一个类似的离心管平衡。 4. 以5000-8000 ×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余100 μl-150 μl液体。 5. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。 【注】： 囊泡可能会有少量的吸附损失，吸附损失取决于囊泡浓度、与过滤纯化内管表面接触的温度和时间。为了最大限度降低损失，离心后请立即回收过滤后的囊泡样本。 6. 为了回收纯化后的囊泡，将内管倒过来插在另一个干净的微量离心管中。放在离心机中，让打开的盖子朝着转子的中央；用一个类似的离心管进行平衡。 7. 以1000 ×g离心2分钟，使纯化后的囊泡样本从纯化内管转移到收集管中。【注】： 要达到理想的回收效果，请尽早进行倒置离心。 也可不倒置离心，直接用移液器直接吸出内管中的样品。 从内管管底吸取纯化好的囊泡时，必须用黄吸头。 用吸头伸入内管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。 8. 吸取收集管中的液体，即得到囊泡样品纯品。 9. 用纯水或PBS缓冲液洗涤内管和收集管，继续纯化下一个样品。【注】： 洗涤内管时，加入400 μl PBS缓冲液或其它缓冲液，用吸头反复吹打，吸掉缓冲液即可。 用PBS洗涤3-4次。 用吸头伸入内管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。 每个离心管内管建议重复使用5次，不要超过10次。 加囊泡悬液或Buffer到内管时，可以用蓝吸头；但从内管管底吸取纯化好的囊泡时，必须用黄吸头。 如果使用过的离心管需要长期保存，可以按下列方法清洗和保存离心管内管。 囊泡纯化离心管清洗和保存： 1. 使用后用水冲洗干净； 2. 内管加入超纯水500 µl，5000×g离心5分钟； 3. 吸净内管中的水，加入500 µl 0.1 M NaOH，5000×g离心20分钟； 4. 用0.1 M NaOH 浸泡24小时； 5. 用水冲洗干净； 6. 用无菌水浸泡2-8℃保存。 7. 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。 【注】： 1个月不用的话，直接用100 mM的NaOH保存！更长时间的话加0.02%的叠氮钠。 再次使用前，用纯水充分冲洗干净，然后根据下游实验需要，用相应的缓冲液平衡。

 蛋白浓度低？很多细胞囊泡量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大培养上清的上样量。处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。请选择高质量的蛋白裂解液或蛋白提取试剂盒。 抽提得到的RNA浓度低？很多细胞囊泡量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大培养上清的上样量。 囊泡纯化管内管膜会因为离心时间过长而变干么？不会，因为内管有死体积，总会有溶液残留在内管中。死体积大约10-20 μl。 可以重复使用过滤管么？可以重复使用。如果使用、清洗、保存得当，可以反复使用多次。但是超过8次重复使用后过滤膜有破损风险，注意使用过程中尽量避免尖锐物品戳到膜。离心力不要过大。 囊泡在纯化时出现了沉淀，如何改进？如果过滤过快或者过度浓缩都有可能引起沉淀。如果样品的囊泡浓度很高，建议降低最终的囊泡浓度，保留更多的液体。对于因过滤速度敏感而导致的沉淀，建议的改进方法是：1）离心力降低30%-50%2）在过滤过程中取出过滤管，用枪头反复吹吸几次。 有时候用囊泡纯化离心管连水都离不下来，可能是什么原因？如果出现这种情况，可能时过滤膜的孔被堵住。请先用0.1M NaOH清洗再离心。最后用缓冲液或纯水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用，如暂时不用，请保持润湿状态，避免重新干燥。 说明书中推荐在室温下进行离心，考虑到囊泡的稳定性，是否可以在4℃进行离心？可以，但是低温可能会增加囊泡样品的粘性，导致流速减慢，建议可将离心时间延长。