2-8℃

 低温有沉淀析出的话可以在37℃短时间水浴溶解，摇匀后使用。 试剂拆封后请尽快使用完！

一年

乳汁，唾液

1.使用方便，无需超速离心，省时省力；
2.纯度高，富集量大，应用范围广；
3.获取的Exosome结构和功能完整；
4.稳定性好，便于运输，便于保存。

根据需要使用

1.离心机 2.移液器 3.冰箱 4.冰盒

1.PBS缓冲液 2.纯水

1.离心管2.吸头3.一次性手套

 以下以2 ml乳汁/唾液为例，实际操作时按乳汁/唾液样本和提取液用量体积比等比例调整使用即可。 不同乳汁/唾液样本外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择乳汁/唾液样本的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的乳汁/唾液样本。 常规的乳汁/唾液样本最佳培养上清上样量为5-10 ml及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的乳汁/唾液样本。 已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。

1. 收集2 ml待提取的乳汁/唾液样品，置2-8℃保存。 2. 将样品在4℃条件下，3000×g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。 3. 小心将上清移入另一干净离心管中。 4. 将样品在4℃条件下，10000×g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。 5. 小心将上清移入另一干净离心管中。 6. 在2 ml乳汁/唾液样品中加入2 ml提取液A，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀1分钟左右，使液体充分混匀。 7. 在4 ml液体样品中加入1 ml提取液B，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀1分钟左右，使液体充分混匀。【注】： 试剂B使用前请充分混匀。 8. 置2-8℃冰箱静置过夜。【注】： 静置保存时间不少于10小时。 9. 在4℃条件下，10000×g离心60分钟。 10. 小心移除上清，收集沉淀。【注】： 尽可能吸干上清。 吸取时小心，防止吸掉沉淀。 11. 取500 μl外泌体保存液将沉淀重悬，用移液器轻轻吹打混匀，得到外泌体沉淀重悬液，进行下列外泌体纯化步骤操作。 清洗外泌体纯化离心管： 1. 用缓冲液或纯水进行预清洗。 2. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。【注】： 可以在外泌体提取步骤中需要使用前再清洗。 重复使用时要仔细检查管壁上有没有裂纹。 外泌体纯化： 1. 将外泌体纯化离心管内管插入所提供的一个微量离心管中。 2. 向内管中加入过500 μl的外泌体沉淀重悬液样本，并盖上盖子。【注】： 用吸头伸入内管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。 加外泌体悬液或Buffer到内管时，可以用蓝吸头；但从内管管底吸取纯化好的外泌体时，必须用黄吸头。 3. 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，让盖子的连接带朝着转子的中央；用一个类似的离心管平衡。 4. 以5000-8000 ×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。 5. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。【注】： 外泌体可能会有少量的吸附损失，吸附损失取决于外泌体浓度、与过滤纯化内管表面接触的温度和时间。为了最大限度降低损失，离心后请立即回收过滤后的外泌体样本。 6. 为了回收纯化后的外泌体，将内管倒过来插在另一个干净的微量离心管中。放在离心机中，让打开的盖子朝着转子的中央；用一个类似的离心管进行平衡。 7. 以1000 ×g离心2分钟，使纯化后的外泌体样本从纯化内管转移到收集管中。 8. 吸取收集管中的液体，即得到外泌体样品纯品。【注】： 可以根据下游实验需要，用相应的缓冲液稀释保存外泌体。 也可直接用于蛋白提取。 将外泌体样本-80℃保存或直接用于下游应用。 外泌体短期保存可以置于2-8℃保存即可，一周以上长期不用时置-80℃保存。 保存前可以用0.22um或0.35um滤器过滤除菌。 9. 用纯水或缓冲液洗涤内管和收集管，继续纯化下一个样品。【注】： 洗涤内管时，加入400μl PBS缓冲液或其它缓冲液，用吸头反复吹打，吸掉缓冲液即可。 用PBS洗涤3-4次。 用吸头伸入内管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。 每个离心管内管建议重复使用5次，不要超过10次。 加外泌体悬液或Buffer到内管时，可以用蓝吸头；但从内管管底吸取纯化好的外泌体时，必须用黄吸头。 如果使用过的离心管需要长期保存，可以按下列方法清洗和保存离心管内管。外泌体纯化离心管清洗和保存： 1. 使用后用水冲洗干净； 2. 内管加入超纯水500 µl，5000×g离心5分钟； 3. 吸净内管中的水，加入500 µl 0.1 M NaOH，5000×g离心20分钟； 4. 用0.1M NaOH 浸泡24小时； 5. 用水冲洗干净； 6. 用无菌水浸泡2-8℃保存。 7. 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。

1.准备做植物外泌体研究，初始样品量需要准备多少？
不同样本外泌体含量差异较大，根据文献选择起始样本量。有条件的情况下尽可能使用多一点样本量。

2.如何鉴定提取的外泌体？
通常使用透射电镜检测（形态）、粒径检测（大小）、外泌体标志蛋白Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。

3.进行外泌体WB鉴定时有什么内参蛋白可供选择？
没有，该检测属于定性检测。

4.蛋白浓度低？
很多样本外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大植物样本的上样量。
处理部分外泌体样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。请选择高质量的蛋白裂解液或蛋白提取试剂盒。

5.外泌体纯化管内管膜会因为离心时间过长而变干么？
不会，因为内管有死体积，总会有溶液残留在内管中。死体积大约20 μl。

6.可以重复使用过滤管么？
可以重复使用。如果使用、清洗、保存得当，可以反复使用多次。但是超过8次重复使用后过滤膜有破损风险，注意使用过程中尽量避免尖锐物品戳到膜。离心力不要过大。

 Yue Zhang et al. Cancer-associated fibroblasts-derived exosomal miR-17-5p promotes colorectal cancer aggressive phenotype by initiating a RUNX3/MYC/TGF-β1 positive feedback loopCancer Letters 2020  Ruiyu Liu et al. iTRAQ-based proteomics and in vitro experiments reveals essential roles of ACE and AP-N in the renin–angiotensin system-mediated congenital ureteropelvic junction obstructionExperimental Cell Research 2020  Feng Tian et al. miR-210 in Exosomes Derived from Macrophages under High Glucose Promotes Mouse Diabetic Obesity Pathogenesis by Suppressing NDUFA4 ExpressionJournal of Diabetes Research 2020