2-8℃

 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。 试剂拆封后请尽快使用完！

一年

细胞培养上清

1.使用方便，无需超速离心，省时省力；
2.纯度高，富集量大，应用范围广；
3.获取的Exosome结构和功能完整；
4.稳定性好，便于运输，便于保存。

根据需要使用

1.离心机 2.移液器 3.冰箱 4.冰盒

1.PBS缓冲液 2.纯水

1.离心管2.吸头3.一次性手套

 以下以4 ml细胞培养上清为例，实际操作时按细胞培养上清样本和提取液用量体积比等比例调整使用即可。 不同细胞分泌的外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择培养基样品的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的细胞培养上清。 一般巨噬细胞、淋巴细胞、造血细胞、胰腺癌细胞等分泌外泌体较多，其它细胞样本建议每个样培养基上清用量不少于8 ml。常规的细胞样本最佳培养上清上样量为15-20 ml及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的细胞培养上清。 条件允许的情况下可以将细胞培养上清浓缩后再提取外泌体。 在收获细胞时，应确定死亡细胞不超过5%。细胞凋亡/死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡，它们在外泌体的提取过程中会污染活细胞产生的外泌体。 已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。

清洗外泌体纯化离心管C： 1. 用缓冲液或纯水进行预清洗。 2. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用前移除并稍微离心甩干。 3. 小心将上清移入另一干净离心管中。 4. 将样品在4℃条件下，10000×g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。 5. 小心将上清移入另一干净离心管中。即为4 ml待提取细胞培养上清（I）。然后进行下列外泌体纯化步骤操作。 外泌体纯化： 1. 将外泌体纯化离心管C内管插入所提供的一个配套离心管中。 2. 向内管中加入过4 ml的待提取细胞培养上清（I）样本，并盖上盖子。 3. 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，用一个类似的离心管平衡。 4. 以4000×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。 5. 在50-100 μl残余液体中加入2 ml外泌体提取液A。 6. 以4000×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。 7. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。 8. 为了回收纯化后的外泌体，用200 μl移液器插入纯化管的底部，吸出纯化后的50 μl - 100 μl纯化外泌体，即得到外泌体样品。 9. 用纯水或缓冲液洗涤内管和收集管，继续纯化下一个样品。 如果使用过的离心管需要长期保存，可以按下列方法清洗和保存离心管内管。 外泌体纯化离心管C清洗和保存： 1. 使用后用水冲洗干净； 2. 内管加入超纯水4 ml，4000×g离心5分钟； 3. 吸净内管中的水，加入4 ml 0.1M NaOH，4000×g离心20分钟； 4. 用0.1 M NaOH 浸泡24小时； 5. 用水冲洗干净； 6. 用无菌水浸泡2-8℃保存。 7. 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。

1.准备做植物外泌体研究，初始样品量需要准备多少？
不同样本外泌体含量差异较大，根据文献选择起始样本量。有条件的情况下尽可能使用多一点样本量。

2.如何鉴定提取的外泌体？
通常使用透射电镜检测（形态）、粒径检测（大小）、外泌体标志蛋白Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。

3.进行外泌体WB鉴定时有什么内参蛋白可供选择？
没有，该检测属于定性检测。

4.蛋白浓度低？
很多样本外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大植物样本的上样量。
处理部分外泌体样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。请选择高质量的蛋白裂解液或蛋白提取试剂盒。

5.外泌体纯化管内管膜会因为离心时间过长而变干么？
不会，因为内管有死体积，总会有溶液残留在内管中。死体积大约20 μl。

6.可以重复使用过滤管么？
可以重复使用。如果使用、清洗、保存得当，可以反复使用多次。但是超过8次重复使用后过滤膜有破损风险，注意使用过程中尽量避免尖锐物品戳到膜。离心力不要过大。

 Yue Zhang et al. Cancer-associated fibroblasts-derived exosomal miR-17-5p promotes colorectal cancer aggressive phenotype by initiating a RUNX3/MYC/TGF-β1 positive feedback loopCancer Letters 2020  Ruiyu Liu et al. iTRAQ-based proteomics and in vitro experiments reveals essential roles of ACE and AP-N in the renin–angiotensin system-mediated congenital ureteropelvic junction obstructionExperimental Cell Research 2020  Feng Tian et al. miR-210 in Exosomes Derived from Macrophages under High Glucose Promotes Mouse Diabetic Obesity Pathogenesis by Suppressing NDUFA4 ExpressionJournal of Diabetes Research 2020