2-8℃

 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。 试剂拆封后请尽快使用完！

一年

细胞培养上清，血清、唾液等液体

1.使用方便，无需超速离心，省时省力；
2.纯度高，富集量大，应用范围广；
3.获取的Exosome结构和功能完整；
4.稳定性好，便于运输，便于保存。

根据需要使用

1.离心机 2.移液器 3.冰箱 4.冰盒

1.PBS缓冲液 2.纯水

1.离心管2.吸头3.一次性手套

 以下以以下以4 ml细胞培养上清和2 ml血清/血浆/体液为例，实际操作时按样本和提取液用量体积比等比例调整使用即可。 不同样本外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择样本的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的样本。 一般巨噬细胞、淋巴细胞、造血细胞、胰腺癌细胞等分泌外泌体较多，其它细胞样本建议每个样培养基上清用量不少于8 ml。常规的细胞样本最佳培养上清上样量为15-20 ml及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的细胞培养上清。 常规的血清/血浆样本最佳上样量为3-5 ml及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的血清/血浆样本。 条件允许的情况下可以将细胞培养上清浓缩后再提取外泌体。 在收获细胞时，应确定死亡细胞不超过5%。细胞凋亡/死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡，它们在外泌体的提取过程中会污染活细胞产生的外泌体。 已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。

清洗外泌体纯化离心管D： 1. 用缓冲液或纯水进行预清洗。 2. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。 3. 小心将上清移入另一干净离心管中。 4. 将样品在4℃条件下，10000×g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。 5. 小心将上清移入另一干净离心管中。即为4 ml待提取细胞培养上清（I）。然后进行下列外泌体纯化步骤操作。 细胞培养上清外泌体纯化： 1. 将外泌体纯化离心管D内管插入所提供的一个配套离心管中。 2. 向内管中加入过4 ml的待提取细胞培养上清（I）样本，并盖上盖子。 3. 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，用一个类似的离心管平衡。 4. 以4000×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。 5. 在50-100 μl残余液体中加入2 ml外泌体提取液A。 6. 以4000×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。 7. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。 8. 为了回收纯化后的外泌体，用200 μl移液器插入纯化管的底部，吸出纯化后的50 μl - 100 μl纯化外泌体，即得到外泌体样品。 9. 用纯水或缓冲液洗涤内管和收集管，继续纯化下一个样品。 如果使用过的离心管需要长期保存，可以按下列方法清洗和保存离心管内管。 体液外泌体提取： 血清、血浆、尿液、脑脊液、腹水、羊水、乳汁、唾液等液体类样本按以下步骤提取。以下步骤中以血清为例，尿液、脑脊液、腹水、羊水、乳汁、唾液等样本与血清步骤相同。 1. 收集2 ml待提取的血清样品，置2-8℃保存。 2. 将样品在4℃条件下，3000×g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。 3. 小心将上清移入另一干净离心管中。 4. 将样品在4℃条件下，10000×g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。 5. 小心将上清移入另一干净离心管中。 6. 在2 ml血清样品中加入2 ml提取液B，盖紧离心管盖。 7. 轻轻上下颠倒混匀1分钟左右，使液体充分混匀。制备成4 ml待提取外泌体悬液（I）。然后进行下列外泌体纯化步骤操作。 体液外泌体纯化： 1. 将外泌体纯化离心管D内管插入所提供的一个配套离心管中。 2. 向内管中加入过4 ml的待提取外泌体悬液样本，并盖上盖子。 3. 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，用一个类似的离心管平衡。 4. 以4000×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。 5. 在50-100 μl残余液体中加入2 ml外泌体提取液A。 6. 以4000×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。 7. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。 8. 为了回收纯化后的外泌体，用200 μl移液器插入纯化管的底部，吸出纯化后的50 μl -100 μl纯化外泌体，即得到外泌体样品。 外泌体短期保存可以置于2-8℃保存即可，一周以上长期不用时置-80℃保存。 保存前可以用0.22um或0.45um滤器过滤除菌。 提取液C备用，如果外泌体浓度过高，可以用试剂C稀释。 9. 用纯水或缓冲液洗涤内管和收集管，继续纯化下一个样品。 外泌体纯化离心管清洗和保存： 1. 使用后用水冲洗干净； 2. 内管加入超纯水4 ml，4000×g离心5分钟； 3. 吸净内管中的水，加入4 ml 0.1 M NaOH，4000×g离心20分钟； 4. 用0.1 M NaOH 浸泡24小时； 5. 用水冲洗干净； 6. 用无菌水浸泡2-8℃保存。 7. 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。

1.准备做植物外泌体研究，初始样品量需要准备多少？
不同样本外泌体含量差异较大，根据文献选择起始样本量。有条件的情况下尽可能使用多一点样本量。

2.如何鉴定提取的外泌体？
通常使用透射电镜检测（形态）、粒径检测（大小）、外泌体标志蛋白Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。

3.进行外泌体WB鉴定时有什么内参蛋白可供选择？
没有，该检测属于定性检测。

4.蛋白浓度低？
很多样本外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大植物样本的上样量。
处理部分外泌体样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。请选择高质量的蛋白裂解液或蛋白提取试剂盒。

5.外泌体纯化管内管膜会因为离心时间过长而变干么？
不会，因为内管有死体积，总会有溶液残留在内管中。死体积大约20 μl。

6.可以重复使用过滤管么？
可以重复使用。如果使用、清洗、保存得当，可以反复使用多次。但是超过8次重复使用后过滤膜有破损风险，注意使用过程中尽量避免尖锐物品戳到膜。离心力不要过大。

 Yue Zhang et al. Cancer-associated fibroblasts-derived exosomal miR-17-5p promotes colorectal cancer aggressive phenotype by initiating a RUNX3/MYC/TGF-β1 positive feedback loopCancer Letters 2020  Ruiyu Liu et al. iTRAQ-based proteomics and in vitro experiments reveals essential roles of ACE and AP-N in the renin–angiotensin system-mediated congenital ureteropelvic junction obstructionExperimental Cell Research 2020  Feng Tian et al. miR-210 in Exosomes Derived from Macrophages under High Glucose Promotes Mouse Diabetic Obesity Pathogenesis by Suppressing NDUFA4 ExpressionJournal of Diabetes Research 2020