-20℃ 避光保存

一年

流式细胞仪/荧光显微镜 /激光共聚焦

细胞

流式细胞仪/荧光显微镜 /激光共聚焦

 流式细胞仪/荧光显微镜/激光共聚焦  离心机  移液器  冰箱  冰盒

 PBS缓冲液  或者HBSS

 离心管  吸头  一次性手套

 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。  细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。  试剂A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。  试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。  由于Calcein-AM的稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。  Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水的吸头。  试剂A母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。  染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。  以下实验步骤仅供参考，以实际的样本和文献参考步骤进行调整。可以染色悬浮培养细胞、贴壁细胞、制备的细胞爬片、涂片等原位染色。

1. 染色工作液的配制： 根据样品数按下列比例配制染色工作液。 用染料稀释液试剂C将染色液A和B分别10倍稀释。 每10ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入100μl稀释过的染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。 每10ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入20-200μl稀释过的染色液B，充分混匀，即成染色工作液B。 2. 收集样本细胞。 【注】：  根据下游检测仪器和应用需要，贴壁细胞时,可以先用胰酶-EDTA等消化细胞，制备成细胞悬液。也可以直接原位染色检测。 3. 用PBS洗涤细胞两次。 【注】：  由于培养基中的血清等含有酯酶，导致Calcein-AM遇水会分解，会导致空白上升，所以需要用PBS洗涤数次直到完全洗净。  贴壁细胞可以原位染色，注意吸除培养基前用培养板离心机离心，防止丢掉漂浮的死细胞。PBS洗涤时也需要离心培养板。 4. 用200μl染色工作液A将细胞重悬。 【注】：  Calcein-AM溶液和EthD-I溶液分开进行染色，先用Calcein-AM染色，再用EthD-I染色。  有时候可添加一定量的非离子表面活性剂如Pluronic F127到Calcein AM内来增强其水溶性。制备染色工作液前，取一管需要用的Calcein AM内加入20% Pluronic F127，使Pluronic F127的终浓度为0.02%。  含Pluronic F127的Calcein AM溶液不可长期保存，现配现用。 5. 在室温或37℃避光孵育15-20分钟。 6. 用PBS洗涤细胞。 【注】：  如有必要，使用含有阴离子转运抑制剂的缓冲液来进行细胞清洗。 7. 用200μl染色工作液B将细胞重悬。 8. 在室温或37℃避光孵育2-5分钟。 9. 用PBS洗涤细胞。 10. 用适量PBS重悬细胞。 11. 用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。最大激发为490nm，最大发射波长为515nm和617nm。 结果分析 ： 荧光显微镜下，使用490±10nm波长激发，活细胞为黄绿色，死细胞为红色。 用528 nm波长激发，能够看到红色的死细胞。

 所有细胞都染上红色？ EthD-3浓度过高会导致活细胞也被染色，需要优化EthD-3的使用浓度，稀释至仅对死细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。  细胞被同时染上绿色和红色？ 样本中有大量晚期凋亡细胞时，细胞胞浆会有Calcein着色并呈碎片状，而且EthD-I也为阳性。