2-8℃避光

1.长期不用可以-20℃保存。
2.试剂拆封后请尽快使用完！

1年

光学显微镜

1.悬浮细胞
2.贴壁细胞

光学显微镜

1.PBS 缓冲液（pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

1.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
2.试剂A有腐蚀性，操作时要小心。
3.试剂C2刚溶解时可能会有沉淀，充分混匀或者漩涡震荡使沉淀全部溶解，之后用于染色实验
4.试剂C2需要避光保存。染色工作液也需要避免光照。
5.染色后的细胞样品可以在 4ºC冰箱保存，需避免光照。
6.细胞β-半乳糖苷酶活性强，孵育3 h即显示阳性；细胞β-半乳糖苷酶活性弱，则需要孵育最长至24 h。细胞染色孵育时间应根据不同细胞样本情况经预实验后选定为 3-24 h。
7. 细胞衰老β-半乳糖苷酶染色反应依赖于特定的pH值，不能用于细胞培养的CO2培养箱中进行染色反应。因为CO2培养箱中较高浓度的CO2会影响染色工作液的pH值，导致染色失败。
8.避免使用细胞状态极差的细胞或过度传代的细胞，可能导致假阳性。

1. 染色工作液配制
实验开始前，将试剂盒内各组分从冰箱内取出，置于室温回温15-20分钟。按以下染色工作液配方，根据实验体系类型，检测样本数，统一配制单次实验需要的染色工作液总量。混匀后，置入37ºC恒温水槽里预热，即为染色工作液。
1.1 将染色剂C2粉剂用染色液C1充分溶解混匀。配成染色液C。
1.2 将300ul染色液C加入10ml染色液B中，充分混匀。配成染色工作液。

2. 细胞染色
2.1贴壁细胞：（96孔板为例）
1） 吸除细胞培养液，用0.1ml洗涤液E洗涤1次，加入0.1ml 固定液A，覆盖整个生长表面。室温固定5分钟。
2） 吸除固定液A，用PBS洗涤细胞3次，每次3分钟。
3） 吸除PBS，每孔加入0.1ml预热的染色工作液，覆盖整个生长表面。
4） 37℃孵育4小时～24小时，或直到细胞呈现蓝色，可以用封口膜或保鲜膜封住细胞培养板防止液体蒸发。
5） 普通光学显微镜下观察和计数：表达SA β-gal的细胞为阳性细胞，呈现蓝绿色。

2.2 悬浮细胞染色：
1） 离心收集细胞至1.5ml离心管内，用0.1ml洗涤液E洗涤1次，加入0.1ml 固定液A，覆盖整个生长表面。室温固定15分钟。固定时可以在摇床上缓慢摇动，以避免细胞结成团块。
2） 离心，吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3分钟。
3） 离心，吸除清洗液A，每管加入0.1ml预热的染色工作液。
4） 37℃孵育3 小时～15小时，或直到细胞呈现蓝色（注：避免液体蒸发）。
5） 取部分染色好的细胞，滴加到载玻片上或6孔板内，普通光学显微镜下观察和计数。

2.3 组织切片染色：
1） 对于石蜡切片先按照常规方法进行脱蜡或水化处理。对于冰冻切片直接按照以下步骤进行；
2） 加入适当体积的固定液A，以充分盖住组织为宜，室温固定不少于15分钟。
3） 用洗涤液E浸泡洗涤组织1次，用PBS洗涤2次，每次不少于5分钟；
4） 吸除PBS，加入适当量的预热的染色工作液。
5） 37℃孵育过夜，可以用封口膜或保鲜膜封住防止蒸发，也可以把整个切片浸泡在染色工作液中。
6）普通光学显微镜下观察和计数。