-20℃ 避光

1.长期不用可以-20℃保存。
2.染色液C02注意防潮；避免反复冻融。
3.染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
4.注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
5.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

荧光显微镜/激光共聚焦

动物细胞

荧光显微镜/激光共聚焦

1.荧光显微镜/激光共聚焦
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒

1.PBS缓冲液 2.HBSS

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2.染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
3.微量试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
4.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
5.由于C02的工作液稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
6.C02对湿度非常敏感，若是C02溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水的吸头。
7.试剂A母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。
8.以下以培养细胞收集后染色为例。原位染色以染色液充分覆盖细胞样本即可。
9.有效染色的前提是相应的细胞模型的活力变化是酯酶活性变化，不影响酯酶活性变化的细胞毒性事件可能不能使用此方法进行准确评估。

染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制染色工作液。
用染料稀释液试剂B将染色液A进行 10倍稀释。
每10ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入100μl稀释过的染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。

荧光显微镜观察：
1. 准备样本细胞。
2. 用PBS洗涤细胞2-3次。
3. 用100-150μl染色工作液A至盖玻片/96孔板将细胞样品覆盖（或重悬）。
4. 在室温或37℃避光孵育20-45分钟。
5. 用PBS洗涤细胞。
6. 用激光共聚焦/荧光显微镜检测结果。最大激发为490 nm，最大发射波长为515 nm。

显微镜结果分析 ：
荧光显微镜下，使用488nm波长激发，活细胞为黄绿色。

流式细胞仪检测：
1. 收集细胞。
2. 用PBS洗涤细胞两次。
3. 制备1 mL细胞悬浮液，浓度为0.1至5×106细胞/ mL。 细胞可以在无血清培养基或其它缓冲液中重悬。
4. 在细胞中加入适量C02溶液和适量PI母液，混匀。
5. 在室温或37℃避光孵育15-30分钟。
6. 尽快用流式细胞仪检测结果。


荧光酶标仪检测：
1. 在微孔板中准备细胞样本孔以及对照孔。
2. 用PBS洗涤细胞2-3次。
3. 加入200μl染色工作液。
4. 在室温或37℃避光孵育15-45分钟。
5. 用PBS洗涤细胞。
6. 加入适量PBS。
7. 用荧光酶标仪/荧光光度计检测结果。最大激发为490 nm，最大发射波长为525 nm。

酶标仪结果分析 ：
可以根据不同荧光强度来计算样品中活细胞和死细胞相对数量（以百分比表示），或者活细胞/死细胞的绝对数量。以下以PI染色为例，实际检测参数以所使用的死细胞探针为准。

% Live Cells =（F(530)sam – F(530)min）÷ （F(530)max – F(530)min）× 100%

% Dead Cells =（F(620)sam – F(620)min）÷（F(620)max – F(620)min）× 100%