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注意微生物污染

一年

1. 注意无菌操作，尽量避免污染。
2. DNA不应含有蛋白和酚。
3. 为了取得较高的转染效率，推荐使用在50代以内的细胞进行转染，转染前细胞必须处于良好的生长状态。
4. 高纯度的质粒是获得高转染效率的必要条件，要确保OD260/OD280≥1.8.
5. 该转染试剂不应涡旋或离心，宜缓慢晃动混匀。
6. 在体外细胞转染实验中，可通过预实验在转染试剂：DNA（ug）=2:1~6:1之间选择最佳比例。
7. 影响转染效率的因素很多，如细胞类型、细胞状态及密度、DNA/siRNA转染量、转染试剂与DNA/siRNA比例等，应再具体实验中优化最佳的转染条件。

DNA转染（以12孔板为例）：
1. 在转染前18~24h用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的12孔板中，并将细胞培养板置于37℃ 5% CO2培养箱培养，待细胞密度大70～90%满时即可进行转染。后续操作步骤均按12孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。
2. 在加入待转染的DNA之前2～4h，加入1ml不含抗生素的完全培养液，置于37℃ 5% CO2培养箱培养。 也可使用含有血清并含有抗生素的新鲜培养液，但抗生素使某些细胞转染后出现一定的细胞毒性。
3. 配制染色工作液：取2个无菌离心管，分别加入50ul不含抗生素和血清的培养液，取其中一离心管加入1.6~3ugDNA，轻轻混匀；取另一离心管加入3ul转染试剂，轻轻混匀。室温静置5min，将含有DNA的培养液用微量移液器轻轻加入含有转染试剂的培养液中，轻轻吹打混匀，室温静置20min。
4. 将上述转染工作液逐滴滴入对应细胞培养液中，轻轻混匀后置于37℃ 5% CO2培养箱培养中培养。
5. 培养4~6h后，更换为含有血清的完全培养液。对于Hela细胞，推荐在转染4h更换培养液；对于NIH3T3、 CHO、 HEK293T和 HEK293FT 细胞，推荐在转染6h更换培养液。
6. 继续培养24~48h后，观察或收集细胞或加入适当的筛选药物如G418等进行稳定细胞株的筛选。

（二）siRNA转染（以12孔板为例）：
1. 在转染前18~24h用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的12孔板中，并将细胞培养板置于37℃ 5% CO2培养箱培养，待细胞密度大50～80%满时即可进行转染。后续操作步骤均按12孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。
2. 在加入待转染的siRNA之前2～4h，加入1ml不含抗生素的完全培养液，置于37℃ 5% CO2培养箱培养。 也可使用含有血清并含有抗生素的新鲜培养液，但抗生素使某些细胞转染后出现一定的细胞毒性。
3. 配制染色工作液：取2个无菌离心管，分别加入50ul不含抗生素和血清的培养液，取其中一离心管加入40pmol siRNA，轻轻混匀；取另一离心管加入2ul转染试剂，轻轻混匀。室温静置5min，将含有siRNA的培养液用微量移液器轻轻加入含有转染试剂的培养液中，轻轻吹打混匀，室温静置20min。
4. 将上述转染工作液逐滴滴入对应细胞培养液中，轻轻混匀后置于37℃ 5% CO2培养箱培养中培养。
5. 培养4~6h后，更换为含有血清的完全培养液。对于Hela细胞，推荐在转染4h更换培养液；对于NIH3T3、 CHO、 HEK293T和 HEK293FT 细胞，推荐在转染6h更换培养液。
6. 继续培养24~48h后，观察或收集细胞。