活性氧检测试剂盒(绿色荧光)(ROS)

BB-4605
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  • 100T
  • 200T
价格
  • ¥1500元
  • ¥2600元
数量
产品概述 product description

贝博® BBoxiProbe® 活性氧检测试剂盒是一种利用新型荧光探针BBoxiProbe® O06进行细胞活性氧检测的试剂盒。本试剂盒中的BBoxiProbe® O06 ROS探针为绿色荧光的活性氧探针,具有488 nm / 520 nm的最大激发/发射波长。 贝博® BBoxiProbe® O06 ROS探针在细胞中活性氧存在的条件下,被氧化生成绿色荧光物质,绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比,检测O06产物的荧光强度就可以知道细胞内活性氧的水平。 在激发波长488 nm,发射波长520 nm附近,使用荧光分光光度计、荧光酶标仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等检测O06产物的荧光强度,从而测定细胞内活性氧水平。 本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的总活性氧的检测。 活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括过氧化氢(H2O2,Hydrogen peroxide)、羟基自由基(•OH,Hydroxyl radical)、单线态氧(1O2,Singlet oxygen)、一氧化氮(NO,Nitric oxide)、超氧阴离子(•O2-,Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO• ,Peroxyl radical)、过氧羟自由基(HOO• ,hydroperoxyl)及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子(ONOO-,Peroxynitrite anion)、ClO-和羟化物等,参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。

保存温度
-20℃ 避光
注意事项
1.探针长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。
2.探针为DMSO溶液,冬季气温较低时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热,否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
4.试剂拆封后请尽快使用完!
有效期
6个月
检测方法
1.荧光分光光度计或荧光酶标仪,荧光显微镜等

适用样本
1.悬浮细胞
2.贴壁细胞
产品特点
1.使用方便:可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测;
2.背景低,灵敏度高;
3.线性范围宽,使用方便。
仪器准备
1.荧光分光光度计或荧光酶标仪,
流式细胞仪、激光共聚焦、荧光显微镜等
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
试剂准备
PBS缓冲液或者HBSS
耗材准备
1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
4.荧光检测专用黑色96孔板
使用注意事项
1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体收集至管底,避免开盖时液体洒落。
2.BBoxiProbe® O06荧光探针在2-8℃时是固体状态,从冰箱取出后恢复至室温,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.本荧光探针在冬季气温较低时在室内时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解,吸头也需要放在培养箱预热,否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
4.使用前,先将本品取出回温至室温(20℃以上),并对其进行简短离心使溶液集中于管底。
5.荧光探针标记后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高。
6.探针标记完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的标记情况是否正常。
7.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间,以减少各种可能的误差。
8.探针标记的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
9.标记的条件因细胞种类而异,根据不同样本的实际染色结果做相应调整,在每次实验前,请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化,确定最佳条件。以下染色操作条件仅供参考。请根据实际样本情况调整或参考文献。
10.酚红对O06荧光探针的检测有轻微干扰,需尽可能避免。
11.以下步骤仅做为参考,稀释比例和孵育时间可根据实际情况来调整。比如,对于某些细胞,如果发现未被刺激的阴性对照细胞荧光也比较强,可降低探针浓度。如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱,可升高O06探针浓度,以提高检测的灵敏度。另外,探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整,孵育温度在4℃-37℃内调整。
12.必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。

使用方法
探针染色工作液配制:
根据样本数量,用HBSS将BBoxiProbe® O06荧光染料1000-2000倍稀释,配制成探针染色工作液。

探针标记
原位标记:仅适用于贴壁培养细胞。
1、 培养板/培养皿准备细胞样本。
2、 待细胞生长到合适丰度,去除细胞培养基,用PBS洗细胞一次。
3、 加入适量体积37℃预热的含O06探针工作液。
4、 在37℃细胞培养箱内于生长状态下避光孵育20分钟~40分钟(具体孵育时间需根据细胞类型而定,需预实验优化)。
5、 移除染色液,用PBS(pH7.4)洗涤细胞3次。以充分去除未进入细胞内的O06探针。
6、 加入200 μL HBSS缓冲液。
7、 荧光酶标仪、荧光显微镜(含合适滤片)检测。最大激发/发射波长为488 nm / 516 nm。

收集后标记:悬浮细胞或贴壁细胞消化处理
1. 离心,吸除上清培养基。
2. 用PBS洗细胞一次。
3. 细胞收集后重悬浮于稀释好的37℃预热的O06探针工作液中,细胞浓度为1*106-2*107/毫升。
4. 于生长状态下37℃细胞培养箱内避光孵育20-30分钟(具体时间需根据细胞类型而定,需预实验优化)。每隔3-5分钟颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。
5. 离心,吸除染色液,加入PBS(pH7.4)重悬细胞,洗涤3次。以充分去除未进入细胞内的O06探针。
6. 用HBSS/PBS/无血清细胞培养基重悬细胞。
7. 用荧光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪检测。
最大激发/发射波长为488 nm / 516 nm。

活性氧检测:
1. 对于原位标记探针的样品可以用荧光酶标仪检测,或者用激光共聚焦显微镜、荧光显微镜,直接拍照分析(需要有相关的荧光强度分析软件)。
2. 或收集细胞后标记探针然后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
3. 对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测,用激光共聚焦显微镜直接拍照分析也可以(需要有相关的荧光强度分析软件)。
4. 使用488 nm激发波长,520 nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。
探针O06的荧光光谱和FITC非常相似,可以用FITC的参数设置检测。
5. 荧光强度强,活性氧含量高。
常见问题分析
1.活性氧结果如何分析?
ROS是多种物质的统称,不像某一单一活性氧指标,无法检测其绝对的含量,只能通过设置参照样本,以参照样本的倍数来反映目标样本相对含量变化,这个“相对”是针对参照的。分析结果是定性的,也是没有单位的,因为它本质上是一个比值(目标/参照)。反映的是模型样本通过具体的干预措施(如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等)如何影响其ROS的变化,测定其ROS是增加或者降低了。

2.荧光照片如何分析?
需要有相关的荧光强度分析软件。ROS表达水平直接通过荧光信号的强弱和分布范围来体现。
有的显微镜扫描下来的图像本身就可以测面积和强度,可以同时测不同颜色的荧光强度。有的显微镜不支持此功能,可以将荧光染色彩色图像转换为黑白的灰度图,然后再以灰度值作为测量指标进行分析。
要结合明场的照片具体分析。如果细胞分布均匀可以算固定面积荧光强度。成像时中心和四周有差异时,一般将四周剪切掉也可以。如果细胞分布不匀,需要找到细胞分布匀称的视野,一个视野一个视野找。
如果要用图片做结果,就要平行做多个图片,作分析,统计,每张都要求荧光分布尽量一致。
为了去除杂光的影响,可以适当调节统计荧光的强度范围,将信号过弱的背景杂光去除掉。对照组和实验组整张图片需要做同样的处理,保证所有参数均要一致。
对于不同情况荧光强度的统计方法,根据实验需要或参考文献。可以算等面积的平均强度;也可以算阈值高于一定值的平均强度;也可以算荧光的累积而不算平均。要根据课题需要选择合适的测量统计方法。
参考文献
1. Gang Zhong et al.
Dopamine-melanin nanoparticles scavenge reactive oxygen and nitrogen species and activate autophagy for osteoarthritis therapy
Nanoscale 2019 (IF=7.233)

2.Jing Zhao et al.
In vitro Characterization of the Rapid Cytotoxicity of Anticancer Peptide HPRP-A2 through Membrane Destruction and Intracellular Mechanism against Gastric Cancer Cell Lines
PloS one 2015 (IF=3.057)

3.Gang Wang et al.
PEG2000-DPSE-coated quercetin nanoparticles remarkably enhanced anticancer effects through induced programed cell death on C6 glioma cells
Journal of Biomedical Materials Research Part A 2013 (IF=3.231)

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