

贝博® BBoxiProbe® 组织羟自由基检测试剂盒(绿色荧光O26)是一种利用新型荧光探针BBoxiProbe® O26进行组织羟自由基检测的试剂盒。本试剂盒中的BBoxiProbe® O26 •OH探针为绿色荧光的羟自由基探针,具有488 nm / 526 nm的最大激发/发射波长。
BBoxiProbe® O26 •OH探针在组织中羟自由基存在的条件下,被氧化生成绿色荧光物质,绿色荧光强度与组织内羟自由基水平成正比,检测O26产物的荧光强度就可以知道组织内羟自由基的水平。
在激发波长488 nm,发射波长526 nm附近,使用荧光分光光度计、荧光酶标仪等仪器检测O26产物荧光强度,从而测定组织内羟自由基水平。
一般最好使用新鲜组织样本检测羟自由基,反映的是组织当时的羟自由基状态。冻存的组织样本的•OH在长期冻存过程中会损失掉,有条件的话就使用新鲜样本,不建议使用冻存的组织样本。已经冻存的组织样本中残余的•OH也可以用本试剂盒检测。
活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括过氧化氢(H2O2,Hydrogen peroxide)、羟基自由基(•OH,Hydroxyl radical)、单线态氧(1O2,Singlet oxygen)、一氧化氮(NO,Nitric oxide)、超氧阴离子(•O2-,Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO• ,Peroxyl radical)、过氧羟自由基(HOO• ,hydroperoxyl)及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子(ONOO-,Peroxynitrite anion)、ClO-和羟化物等,参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。
活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生主要是氧化磷酸化的结果,在呼吸链中,在某些位点会有“泄露”的电子直接和氧气或和其他电子受体反应,在酶或非酶作用下引发一系列反应生成不同种类的活性氧:“泄露”的电子最初和氧气反应生成超氧阴离子自由基(O2·-)(图1A)。超氧阴离子遇水生成H2O2(图1B),同时过氧化氢也可由氧气在单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成(图1C),生成的过氧化氢在髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的催化下与Cl-反应可生成ClO-(图1D),在铁或铜离子的催化下发生Fenton反应生成OH·(图1E),超氧阴离子遇氮氧化物反应生成ONOO-(图1F)。这些生成的高氧化活性的物质统称为活性氧。
BBoxiProbe® O系列羟自由基探针具有多种颜色可以选择,可根据情况对样品进行多色标记实验。除了本试剂盒的绿色荧光探针,贝博® 还可以提供红色、蓝色、深红色荧光的羟自由基检测试剂盒。
2. 探针液O26为DMSO溶液,冬季气温较低时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3. 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热,否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
2. 荧光分光光度计
2. 冻存组织
2. 背景低,灵敏度高;
3. 线性范围宽,使用方便。
激发波长488-535 nm,发射波长606 nm。
2. 匀浆机/匀浆器
3. 离心机
4. 移液器
5. 冰箱
冰盒
BCA蛋白定量试剂
2. 吸头
3. 一次性手套
黑色96孔板
2. O26染色液为DMSO溶液,冬季气温较低时在室温时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解,吸头也需要放在培养箱预热,否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
3. 使用前,先将本品取出回温至室温,并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
4. 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间,以减少各种可能的误差。
5. 必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。
根据样本数量,用纯水将O26探针10倍稀释。充分混匀,备用。
样本处理:
1. 刚取得的新鲜组织样本用PBS洗净。
2. 准确称取50 mg或100 mg组织样本,加入500 μl-1 ml匀浆缓冲液A,用匀浆机/匀浆器充分匀浆。
3. 在100×g,4℃离心5分钟,取上清备用。
样本检测:
1. 在96孔板中加入190微升匀浆上清液、10微升O26探针,用移液器吹打,使之充分混匀。
2. 在37℃避光孵育20-30分钟。
3. 置于酶标仪中,激发波长为488 nm、发射波长526 nm检测荧光强度。
蛋白定量:
1. 另取50微升上清匀浆液,用PBS大约稀释30倍。
2. 取100微升进行蛋白定量。
结果处理:
以荧光强度(RFU)/蛋白浓度(毫克蛋白)表示组织羟自由基强度。
•OH通过设置参照样本,以参照样本的倍数来反映目标样本相对含量变化,这个“相对”是针对参照的。分析结果是定性的,也是没有单位的,因为它本质上是一个比值(目标/参照)。反映的是模型样本通过具体的干预措施(如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等)如何影响其•OH的变化,测定其•OH是增加或者降低了。
2. 荧光强度在变化?
可以观察到荧光的逐渐增加(由于自动氧化)或减少(由于细胞中的染料损失或光漂白)。在没有任何刺激或诱导的情况下,健康的未经处理的细胞中的荧光突发可以指示细胞死亡或一些其他氧化事件的进展。
注意检测时平行操作即可。
An oral bacterial pyroptosis amplifier against malignant colon cancer
Nano Today 2024 (IF 20.722)
4. Yu Zhang et al.
A Vanadium-Based Nanoplatform Synergizing Ferroptotic-like Therapy with Glucose Metabolism Intervention for Enhanced Cancer Cell Death and Antitumor Immunity
ACS Nano 2023 (IF 18.027)
5. Jianqi Zhao et al.
Clustered Cobalt Nanodots Initiate Ferroptosis by Upregulating Heme Oxygenase 1 for Radiotherapy Sensitization
Small 2023 (IF 15.153)
6. Hongyun Lu et al.
Efficient delignification of sugarcane bagasse by Fenton oxidation coupled with ultrasound-assisted NaOH for biotransformation from Agaricus sinodeliciosus var. Chaidam
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7. Junjie Liu et al.
Tumor cell-activated “Sustainable ROS Generator” with homogeneous intratumoral distribution property for improved anti-tumor therapy
Theranostics 2021 (IF 12.400)
8. Junjie Liu et al.
Boosting tumor treatment by dredging the hurdles of chemodynamic therapy synergistic ion therapy
Chemical Engineering Journal 2021 (IF 16.744)
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