贝博® BBoxiProbe® Green活性氧(ROS)检测试剂盒是一种利用荧光探针Green进行活性氧检测的试剂盒。Green本身荧光较弱,可自由透过活细胞膜进入细胞内,并被细胞内的ROS氧化,氧化产物荧光强度增大,产生明亮的绿色荧光。 根据活细胞中绿色荧光的产生,可以判断细胞ROS含量的多少和变化。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察,是一种快速简便的活细胞中ROS经典检测方法。绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比,检测荧光强度就可以知道细胞内活性氧的水平。 在激发波长488nm,发射波长520 nm附近,使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测荧光,从而测定细胞内活性氧水平。 活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括过氧化氢(H2O2,Hydrogen peroxide)、羟基自由基(•OH,Hydroxyl radical)、单线态氧(1O2,Singlet oxygen)、一氧化氮(NO,Nitric oxide)、超氧阴离子(•O2-,Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO• ,Peroxyl radical)、过氧羟自由基(HOO• ,hydroperoxyl)及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子(ONOO-,Peroxynitrite anion)、ClO-和羟化物等,参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生主要是氧化磷酸化的结果,在呼吸链中,在某些位点会有“泄露”的电子直接和氧气或和其他电子受体反应,在酶或非酶作用下引发一系列反应生成不同种类的活性氧:“泄露”的电子最初和氧气反应生成超氧阴离子自由基(O2•-)(图1A)。超氧阴离子遇水生成H2O2(图1B),同时过氧化氢也可由氧气在单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成(图1C),生成的过氧化氢在髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的催化下与Cl-反应可生成ClO-(图1D),在铁或铜离子的催化下发生Fenton反应生成OH•(图1E),超氧阴离子遇氮氧化物反应生成ONOO-(图1F)。这些生成的高氧化活性的物质统称为活性氧。 贝博® 还可以为您提供各种组织、细胞样本、切片样本的活性氧(ROS)、活性氮(RNS)的各种荧光颜色的检测试剂盒产品。 贝博® BBcellProbe® 可以提供细胞凋亡、增殖、毒性、活性氧、细胞代谢、氧化应激、细胞膜流动性、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、细胞内pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种检测试剂盒产品。 贝博® BBcellProbe® 可以为您提供各种颜色的BBcellProbe® M系列、N系列、L系列、E系列、G系列等细胞膜、细胞质、细胞核、溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体、骨架、微管等细胞、细胞亚结构荧光染色试剂盒产品,以及钙离子、钠离子、氩离子等各种荧光染色试剂盒产品。 贝博® BBcellProbe® 可以提供动物、植物、微生物、酵母、水产、家禽、兽类、土壤等样本的各种生化指标检测的数百种试剂盒产品。
2.可以根据需要分装后冻存。
3.探针为DMSO溶液,在2-8℃时是固体状态,冬季气温较低时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解,从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
2.贴壁细胞
2.背景低,灵敏度高;
3.线性范围宽,使用方便。
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
2.吸头
3.一次性手套
4.荧光检测专用黑色96孔板
2.荧光探针标记后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高。
3.探针标记完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的标记情况是否正常。
4.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间,以减少各种可能的误差。
5.CellROX Green在光照和空气中易被氧化,注意避光密封保存。
6.对不同的细胞和组织,应选择合适的孵育时间和浓度,以观察ROS的变化,很多细胞内的ROS绝对水平较低,需要根据实际情况适当延长孵育时间。
7.CellROX Green探针可以根据需要的用量分装后冻存,避免反复冻融。
8.CellROX Green不可以一次性全部稀释后长期保存不用,稀释后稳定性变差,有效期缩短。
9.标记的条件因细胞种类而异,根据不同样本的实际染色结果做相应调整,在每次实验前,请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化,确定最佳条件。以下方法仅供参考。
10.原位检测必须使用荧光检测专用的黑色透明底96孔细胞培养板。
CellROX Green探针配制:
1. 根据需要的用量,用新鲜无酚红无血清培养基或HBSS缓冲液稀释CellROX Green探针后充分混匀,避光保存备用。
2. 探针使用终浓度200-1000倍稀释。一般预实验起始浓度按500倍即可。
CellROX Green探针标记:
1. CellROX Green溶液可在新鲜无血清培养基、HBSS缓冲盐溶液中稀释到所需浓度,终浓度200-1000倍稀释,以此染色液更换细胞培养基;也可直接向无血清细胞孵育液体中加入CellROX Green探针溶液至所需浓度。
2. 依据细胞ROS含量的不同,CellROX Green终浓度可选择在200-1000倍稀释的范围,孵育时间可选择30分钟-4小时,在37℃或室温进行避光孵育。
3. 孵育结束后,用PBS等新鲜缓冲液清洗细胞或组织。漂洗时间要短。
荧光显微镜观察:
1. 对贴壁生长细胞或活组织,可直接在荧光显微镜下观察;对悬浮生长细胞,取25-50μl细胞悬液滴到一张显微载玻片上,再盖上一张盖玻片。
2. 荧光显微镜下观察。
流式细胞仪分析:
1. 染色并洗涤细胞后用0.5~1 ml冷PBS重悬细胞(5~10万)。
2. 采用488 nm波长激发,发射波长520 nm,测定待测细胞平均荧光强度。
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