活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括过氧化氢(H2O2,Hydrogen peroxide)、羟基自由基(•OH,Hydroxyl radical)、单线态氧(1O2,Singlet oxygen)、一氧化氮(NO,Nitric oxide)、超氧阴离子(•O2-,Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO• ,Peroxyl radical)、过氧羟自由基(HOO• ,hydroperoxyl)及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子(ONOO-,Peroxynitrite anion)、ClO-和羟化物等,参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生主要是氧化磷酸化的结果,在呼吸链中,在某些位点会有“泄露”的电子直接和氧气或和其他电子受体反应,在酶或非酶作用下引发一系列反应生成不同种类的活性氧:“泄露”的电子最初和氧气反应生成超氧阴离子自由基(O2•-)(图1A)。超氧阴离子遇水生成H2O2(图1B),同时过氧化氢也可由氧气在单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成(图1C),生成的过氧化氢在髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的催化下与Cl-反应可生成ClO-(图1D),在铁或铜离子的催化下发生Fenton反应生成OH•(图1E),超氧阴离子遇氮氧化物反应生成ONOO-(图1F)。这些生成的高氧化活性的物质统称为活性氧。 贝博® BBoxiProbe® 羟自由基检测试剂盒是利用羟自由基特异性荧光探针HPF(hydroxyphenyl fluorescein)检测羟自由基的试剂盒。BBoxiProbe® HPF羟自由基探针是贝博合成的羟苯基荧光素类荧光探针,可以自由穿过细胞膜,进入细胞内后,与细胞内羟自由基反应,被氧化生成绿色荧光物质,绿色荧光强度与细胞内羟自由基水平成正比,检测绿色荧光就可以知道细胞内羟自由基的变化情况。 HPF具有极低的的非特异性反应性和较高的光致氧化抗性。在与羟基自由基反应之前是无荧光的,被羟自由基氧化后,HPF呈现明亮的绿色荧光(激发/发射最大值〜490/515 nm),使其与任何可检测荧光素的仪器兼容,可以使用荧光成像,高含量成像,微孔板荧光测定法或流式细胞术来测量所产生的荧光。 贝博® BBcellProbe® 可以提供细胞凋亡、增殖、毒性、活性氧、细胞代谢、氧化应激、细胞膜流动性、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、细胞内pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种检测试剂盒产品。 贝博® BBcellProbe® 可以为您提供各种颜色的BBcellProbe® M系列、N系列、L系列、E系列、G系列等细胞膜、细胞质、细胞核、溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体、骨架、微管等细胞、细胞亚结构荧光染色试剂盒产品,以及钙离子、钠离子、氩离子等各种荧光染色试剂盒产品。 贝博® BBcellProbe® 可以提供动物、植物、微生物、酵母、水产、家禽、兽类、土壤等样本的各种生化指标检测的数百种试剂盒产品。
2.可以根据需要分装后冻存。
3.探针为DMSO溶液,在2-8℃时是固体状态,冬季气温较低时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解,从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
2.贴壁细胞
2.背景低,灵敏度高;
3.线性范围宽,使用方便。
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
2.吸头
3.一次性手套
4.荧光检测专用黑色96孔板
2.荧光探针标记后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高。
3.探针标记完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的标记情况是否正常。
4.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间,以减少各种可能的误差。
5.HPF染色液为DMSO溶液,冬季气温较低时在室温时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解,吸头也需要放在培养箱预热,否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
6.使用前,先将本品取出回温至室温,并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
7.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
8.标记的条件因细胞种类而异,根据不同样本的实际染色结果做相应调整,在每次实验前,请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化,确定最佳条件。以下方法仅供参考。
9.酚红对HPF荧光探针的检测有干扰,需避免。
10.血清对HPF荧光探针的检测有干扰,需避免。
11.染色后立即进行分析。
12.以下步骤仅做为参考,稀释比例和孵育时间可根据实际情况来调整。比如,对于某些细胞,如果发现未被刺激的阴性对照细胞荧光也比较强,可降低探针浓度。如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱,可升高HPF探针浓度,以提高检测的灵敏度。另外,探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整,孵育温度在4℃-37℃内调整。
根据样本数量,用HBSS将BBoxiProbe® HPF荧光染料100倍稀释,配制成染色工作液。
2. 细胞探针标记
2.1 对于贴壁细胞,可以进行原位标记
1)培养皿/培养板准备细胞样本。
2)待细胞生长到合适丰度,吸除培养液,加入适量37℃预热的含探针工作液。于生长状态下孵育20分钟~60分钟(具体孵育时间需根据细胞类型而定,需预实验优化)。
3)移除染色液,用PBS(pH7.4)洗涤细胞3次。
4)荧光显微镜(含合适滤片)或流式细胞仪、荧光酶标仪下观察。最大激发/发射波长为488 / 515 nm。
2.2 对于悬浮细胞
1)离心,吸除上清。
2)利用37℃预热的探针工作液100-200 μl重悬细胞,于生长状态下孵育20分钟~60分钟(具体时间需根据细胞类型而定,需预实验优化)。
3)离心,吸除染色液,加入PBS(pH7.4)重悬细胞,洗涤3次。
4)流式细胞仪、荧光酶标仪检测。最大激发/发射波长为488 / 515 nm。
3. 检测:
对于原位标记探针的样品可以用荧光显微镜,激光共聚焦显微镜直接观察,或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测,用激光共聚焦显微镜直接观察亦可。
使用488 nm激发波长,515 nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。BBoxiProbe® HPFF的荧光光谱和FITC非常相似,可以用FITC的参数设置进行检测。
Genotoxicity of microcystin-LR in mammalian cells: Implication from peroxynitrite produced by mitochondria
Ecotoxicology and Environmental Safety 2020
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