2-8℃ 避光

开盖后组份按要求条件保存。

6个月

分光光度计

血清血浆/全血/组织

分光光度计

1.分光光度计
2.台式离心机
3.移液器
4.恒温水浴锅

1.蒸馏水

1.吸头
2.一次性手套

1.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
2.空白管、标准管一般只需做1-2只
3.在正式实验前务必做预实验摸索最佳取样浓度。最佳取样量及最佳取样浓度因样品种类不同，其GSH-PX活力不一。根据酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，各种测定样品取样量及取样浓度不一样，在每测定一种新的样品前最好选择一个最佳取样量及最佳取样浓度；
4.溶血液在室温1小时内活力不变，建议样品稀释后不超过1小时测试。
5.血样要新鲜。肝素抗凝后放冰箱不超过48小时。
6.试剂A的瓶子要洗干净，工作液现用现配。
7.GSH标准品要现用现配。
8.37℃水浴反应时间5分钟要准确。
9.测定上清液当天提取，当天测定；

一、样本制备：
血清、血浆样本： 按常规方法制备，可以直接用于本试剂盒的测定，-20℃冻存。

二、试剂的配制

GSH工作液的配制：


全血GSH-PX活力测定

1、样本处理
溶血液配制：
⑴ 取肝素抗凝全血20ul，用蒸馏水稀释至1ml，配成1:49的溶血液；
鼠血10ul，用蒸馏水稀释至1ml，配成1:99的溶血液。
⑵ 充分混匀，放置5分钟直至玻璃管中的溶血液对光呈完全透明状，方可进行检测。
⑶ 配好的溶血液中GSH-PX活力只能保持45分钟-60分钟，室温较低时可延长至120分钟。抗凝全血可在2-8℃保存2-3天。
注：1、测溶血液中GSH-PX含量要注意样品测试前红细胞一定要充分溶血。
2、正式实验前请先取1~2个样本做预实验；

2、GSH-PX酶活力测定：
⑴ 酶促反应：（注：试剂A工作液提前在37℃预温）


⑵ 显色反应：按下列配方和步骤进行

3、全血中GSH-PX的活力的计算：
⑴ 定义：每4ul全血在37℃反应5分钟，扣除非酶促反应的作用，使反应体系中GSH浓度降低1umol/L为一个酶活力单位。
⑵ 计算：
非酶管OD-酶管OD 1+X
GSH-PX酶活力= X标准液浓度（20umol/L）X 稀释倍数（5X ）
标准管OD-空白管OD 1+49
注： 5：从酶促反应表中反应液0.5ml加试剂B2ml，在反应液中为5倍稀释，所以乘5.
X：为全血稀释比例，例如1:99稀释，X为99
1+49：溶血液为1:49稀释时，取0.2ml检测即等同于取样量为4ul的全血。

4、溶血液的最佳取样浓度及最佳取样量的摸索举例；
1.样本来源：正常组新鲜大鼠尾部全血；
2.样本前处理：分别用蒸馏水将大鼠全血按1：24、1:49、1:59、1:69、1:79、1:89、1:99、1:149、1:199的比例稀释成一系列不同浓度的溶血液，分别取一系列不同浓度溶血液0.2ml按全血的测定操作表进行检测。

5、计算举例：
A: 取1:49溶血液0.2ml进行测定，测得非酶管OD值0.463，酶管OD值为0.228，标准管OD值为0.165，空白管OD值0.041，
酶活力=（0.463-0.228）/ (0.165-0.041) X 20 X 5 X 50/50 =189.52酶活力单位
B: 取1:149溶血液0.2ml进行测定，测得非酶管OD值0.451，酶管OD值为0.205，标准管OD值为0.165，空白管OD值0.041，
酶活力=（0.451-0.205）/ (0.165-0.041) X 20 X 5 X 150/50 =595.16酶活力单位

组织、线粒体、细胞膜GSH-PX活力测定

1、样本处理
10%组织匀浆的制备：
⑴ 取组织块200mg-1g，用冷生理盐水漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入5-10ml的小烧杯内。
⑵ 用量筒量取9倍重量的预冷的匀浆介质（pH7.4,0.01mol/L蔗糖，0.01mol/L Tris-HCl，0.0001mol/L EDTA2Na溶液）或生理盐水。用移液器将总量2/3的匀浆介质或生理盐水移入烧杯。用眼科小剪刀尽快剪碎组织块（天热时小烧杯要放入冰水中）；
⑶ 将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3的匀浆介质或生理盐水用来冲洗残余在小烧杯中的碎组织一起倒入玻璃匀浆管中进行匀浆（6-8分钟）。充分磨碎，使组织匀浆化；也可使用组织捣碎机10000-15000r/min，研磨制成10%组织匀浆；
⑷ 将制备好的10%匀浆3000r/min离心10-15分钟，取上清。

线粒体的制备：
取10%组织匀浆5-10ml，以1000-2000r/min离心10分钟，取上清，8000-10000r/min离心15分钟，沉淀为线粒体。

2、GSH-PX酶活力测定：
⑴ 酶促反应：（注：试剂A工作液提前在37℃预温）

⑵ 显色反应：按下列配方和步骤进行
↓
混匀。室温静置15分钟，412nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，测各OD值。

3、组织中GSH-PX的活力的计算：
⑴ 定义：每mg蛋白质，扣除非酶促反应的作用，使反应体系中GSH浓度降低1umol/L为一个酶活力单位。
⑵ 计算：
非酶管OD-酶管OD
GSH-PX酶活力= X标准液浓度（20umol/L）X稀释倍数（5）÷反应时间
标准管OD-空白管OD

÷(取样量X样本蛋白浓度)

注： 1.从酶促反应表中反应液0.5ml加试剂B2ml，在反应液中为5倍稀释，所以乘5.
2.组织蛋白的测定：可以用BCA 或Bradford蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测定；
4、组织匀浆的最佳取样浓度及最佳取样量的摸索举例；
（1）样本来源：正常组小鼠肝组织，制备成10%肝匀浆上清，用生理盐水稀释成1%，待测；
（2）样本前处理：分别用生理盐水将1%肝匀浆稀释成1.0%、0.5%、0.4%、0.3%、0.25%、0.2%、0.1%、0.05%一系列不同浓度的组织匀浆，分别取一系列不同浓度组织匀浆0.2ml按组织的测定操作表进行检
5、计算举例：
取0.25%小鼠肝组织匀浆0.2ml进行测定，测得非酶管OD值0.480，酶管OD值为0.172，标准管OD值为0.163，空白管OD值0.041，1%匀浆蛋白浓度0.910mg/ml，
酶活力=（0.480-0.172）/ (0.163-0.041) X 20 X 5 ÷（0.910÷4*0.2）=1109.71酶活力单位
测酶活力用0.25%匀浆，蛋白定量用1%匀浆，所以除以4.

血清、血浆GSH-PX活力测定

1、GSH-PX酶活力测定：
⑴ 酶促反应：（注：试剂A工作液提前在37℃预温）
⑵ 显色反应：按下列配方和步骤进行
2、血清中GSH-PX的活力的计算：
⑴ 定义：每0.1ml血清在37℃反应5分钟，扣除非酶促反应的作用，使反应体系中GSH浓度降低1umol/L为一个酶活力单位。
⑵ 计算：
非酶管OD-酶管OD
GSH-PX酶活力= X标准液浓度（20umol/L）X稀释倍数（6）
标准管OD-空白管OD

X测试前稀释倍数

注： 从酶促反应表中反应液0.4ml加试剂B2ml，在反应液中为6倍稀释，所以乘6.

4、血清（浆）的最佳取样浓度及最佳取样量的摸索举例；
（1）样本来源：正常组大鼠眼眶取全血，肝素钠抗凝取血浆；
（2）样本前处理：分别用生理盐水将血浆按1:1、1:4、1:7、1:9、1:14、1:19一系列不同浓度的血浆，分别取一系列不同浓度血浆0.1ml按血清（浆）的测定操作表进行检