2-8℃ 避光

1.试剂拆封后请尽快使用完！

6个月

分光光度计

组织、细胞

分光光度计

1.分光光度计
2.恒温水浴锅
3.离心机
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒
7.涡旋混匀器

1.纯水
2.蛋白定量试剂盒

1.比色皿
2.试管
3.吸头
4.一次性手套

1.试剂E乙液在冬天或4℃长时间保存可能会出现凝胶状物质，37℃溶解不了，可将其60℃左右水浴10分钟即可完全溶解；
2.试剂E甲液和乙液应防止磷污染；

一、试剂配制
1．试剂C的配制：
使用前每支粉剂C加纯水1ml，充分溶解。
【注】：
 根据样品数量现用现配，未用完部分-20℃保存，一周有效。

2．显色剂的配制：
取试剂E的甲液一瓶加入一瓶已预温好的试剂E的乙液中，充分混匀。
需提前0.5小时配制，2-8℃条件下可保存5天。
配好的显色剂的量够做13个管子。
如果样本量很少，所需的显色剂的量较少，可以按试剂E中的甲液：乙液=7:6的比例自行配制显色剂，用多少配制多少。（按比例配制显色剂要防止磷污染，最好用专用的吸嘴）
【注】：
 乙液在冬天或4℃长时间保存可能会出现凝胶状物质，37℃溶解不了，可将其60℃左右水浴10分钟即可完全溶解。
 甲液和乙液要防止磷污染。

3．0.1umol/ml标准磷工作液的配制：
使用前将10mmol/L标准磷储备液100稀释，即取0.1ml储备液加纯水至10ml；

4．0.02umol/ml标准磷工作液的配制：
将0.1umol/ml标准磷工作液用纯水稀释5倍，即取0.1umol/ml标准磷工作液1ml加纯水至5ml；

5．基液的配制：
将试剂A、B、C按260:80:80比例混合。需多少配多少，现配现用。

6. 试剂I的配制：
用时取一支稀释液I2加入到一支粉剂I1中，充分溶解。
【注】：
 根据样品数量现用现配，未用完部分4℃保存，一周有效。
7. 试剂J的配制：
用时取一支稀释液J2加入到一支储备液J1中，充分混匀。
【注】：
 根据样品数量现用现配，未用完部分4℃保存，一周有效。

二、样本的前处理：
1. 组织的前处理：
准确称取组织重量，按重量（g）：体积（ml）=1:9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2500转/分，离心10分钟，取上清液（即10%的匀浆上清液），再用生理盐水10倍稀释成1%，同时用考马斯亮蓝试剂测定组织蛋白浓度。
【注】：
 如果预试结果太高，再将1%的组织匀浆稀释成不同浓度再进行预试后再决定取样浓度。

2．培养细胞的前处理：
将培养细胞消化，离心、弃上清，留下层细胞，每管加0.2~0.3ml生理盐水或匀浆介质制备成107/cm3细胞悬液，即107/ml，再进行破碎。
破碎细胞的方法有三种：
① 用匀浆器匀浆；
② 用超声粉碎器粉碎；
③ 反复冻融3次
第三种方法有时会影响酶活力；
制备好的细胞悬液不需要离心，同时用考马斯亮蓝试剂测定组织蛋白浓度。再将细胞匀浆液稀释成不同浓度进行预试，根据预试结果决定取样浓度。
【注】：
 在测试加样前要摇匀后取样；
 不可用磷酸盐缓冲液或含磷的试剂作为样本匀浆或稀释样本
 预试结果将绝对吸光度值（测定管吸光度值-对照管吸光度值）控制在0.2左右为宜。


三、 操作步骤：
1. 酶促反应：
混匀，3500转/分，离心10分钟，取上清定磷。

2．定磷：
混匀，室温静置5分钟，纯水调零，636nm，1cm光径，测各管OD值。

【注】：
 在比色前，将比色皿用自来水冲洗10余次，再用纯水冲洗4~5次，以免磷污染。










如果样本数量较多，可以采用简便操作法进行酶促反应：

基质液的配制:参见前面（一、试剂配制），现配现用。

1. 酶促反应：
混匀，3500转/分，离心10分钟，取上清定磷。

2．定磷：
混匀，室温静置5分钟，纯水调零，636nm，1cm光径，测各管OD值。

【注】：
 在比色前，将比色皿用自来水冲洗10余次，再用纯水冲洗4~5次，以免磷污染。


四．计算：
组织、细胞中ATPase的计算
定义：每小时每mg组织（细胞）蛋白的组织（细胞）中ATP酶分解ATP产生1umol
无机磷的量为一个ATP酶活力单位。即umolPi/mgprot/hour

ATPase活力（U/mgprot）=（样品OD-对照OD）÷（标准OD-空白OD）×标准品浓度
×60 ÷ T ×N÷待测样本蛋白浓度（mgprot/ml）


注：
1. 标准品浓度，0.02μmoL/ml；
2. T：酶促反应时间，10min；
3. N：酶促反应体系稀释倍数，7.8；


计算举例：
取0.1%的小鼠肝组织浆按操作表进行检测，测得空白管吸光度为 0.052，标准管吸光度为0.255，对照管吸光度为0.280,测得Na+/k+ ATP酶管吸光度为0.378；Ca++/Mg++ATP酶管吸光度为0.460；总 ATPase 管吸光度为0.645。同时测得0.1%的小鼠肝组织匀浆蛋自含量为
0.998mgprot/mL。则计算结果为:

Na+/k+ ATP酶 = 0.378-0.280 x 0.02 x 60 x 7.8 + 0.0998
活力(U/mgprot) 0.255-0.052 10
= 4.528 u/mgprot

Ca++/Mg++ATP酶 = 0.460-0.280 x 0. 02 x 60 x7.8 +0.0998
活力(U/mgprot) 0.255-0.052 10
= 8.316 U/mgprot

总TP酶 = 0.645-0.280 x 0. 02 x 60 x7.8 +0.0998
活力(U/mgprot) 0.255-0.052 10
= 16.863 U/mgprot

1.Xuliang Guo et al.
Curved corannulene dually targets mitochondria and endoplasmic reticulum, and initiates apoptosis via localized ROS induction upon light triggering
Materials Science & Engineering C 2020 （IF = 8.457）

2.Gang Wang et al.
Effects of quercetin nanoliposomes on C6 glioma cells through induction of type III programmed cell death
International Journal of Nanomedicine 2012 （IF = 8.000）