bestbio@163.com
服务热线：021-33921235
登录
说明书下载
保存温度
2-8℃
注意事项
1. 焦亡试剂BE短期4℃避光保存，长期-20℃避光保存；。
2. 焦亡试剂B在冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
2. 焦亡试剂B在冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
有效期
一年
适用样本
动物细胞
试剂准备
1. PBS缓冲液 或者HBSS
2. 蛋白定量试剂盒3. 纯水
2. 蛋白定量试剂盒3. 纯水
耗材准备
1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套
4. 黑色透明底细胞培养板
2. 吸头
3. 一次性手套
4. 黑色透明底细胞培养板
使用注意事项
1. 须自备可以测定A405或A400的酶标仪或容量不超过100μl的分光光度检测杯及相应分光光度计。优先考虑测定A405。
2. 37℃下反应如果颜色变化不明显，可以适当延长反应时间。
3. 如果样品中蛋白含量低，加大样品量，裂解样品时需设法使样品中的蛋白量达到200-500ug每样。
4. 如果样品中激活的焦亡水平很低，适当调节诱导细胞焦亡的时间，找一个焦亡激活比较强的时间点进行检测。
5. 焦亡试剂避光保存，使用过程中尽量避光。
6. 试剂为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
7. 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
8. 每个样需要准备两份，分别用于caspase活性检测和细胞膜完整性检测。
2. 37℃下反应如果颜色变化不明显，可以适当延长反应时间。
3. 如果样品中蛋白含量低，加大样品量，裂解样品时需设法使样品中的蛋白量达到200-500ug每样。
4. 如果样品中激活的焦亡水平很低，适当调节诱导细胞焦亡的时间，找一个焦亡激活比较强的时间点进行检测。
5. 焦亡试剂避光保存，使用过程中尽量避光。
6. 试剂为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
7. 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
8. 每个样需要准备两份，分别用于caspase活性检测和细胞膜完整性检测。
使用方法
一、 裂解缓冲液和检测缓冲液配制
根据待测样品数准备裂解缓冲液和检测缓冲液，每1 ml缓冲液中加入10 μl 试剂D。
充分混匀置冰上备用。
二、 样品处理
1. 收集2-5×106个以上细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 在细胞中加入50 μl冷的裂解缓冲液，高速涡旋振荡15秒。
4. 置冰上持续振荡25-40分钟。
5. 在4℃，10000×g条件下离心10分钟。
6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
三、 对上述处理过的上清进行蛋白定量。
四、 焦亡检测
1、 取40-50 μl大约含100-200 μg蛋白的裂解上清，加入50 μl检测缓冲液。
2、 加入10 μl 焦亡试剂B，充分混匀。在37℃下避光反应1-4小时，有黄色颜色产生即可进行检测。
3、 测定A405 nm或A400 nm。
4、 吸光值与焦亡活性程度成正比。
五、 细胞膜完整性测定
1. 染色工作液的配制：
用纯水将洗涤缓冲液F（10X）10倍稀释（1 ml 试剂F加9 ml纯水充分混匀），充分混匀，配制成洗涤缓冲液工作液（1X）备用。
根据样品数用洗涤缓冲液工作液将焦亡试剂E 100倍稀释，配制成染色工作液。
2. 用洗涤缓冲液工作液洗涤细胞两次。
3. 加适量染色工作液于细胞，室温避光染色5-20分钟。
4. 用荧光设备检测结果。探针的最大激发波长为488 nm，最大发射波长为620 nm。
5. 结果分析 ：
置于荧光设备下检测结果。激发光波长为488 nm，发射光波长620 nm。
正常细胞不能着色，焦亡细胞呈红色荧光。
荧光强度强，焦亡细胞比例高。
根据待测样品数准备裂解缓冲液和检测缓冲液，每1 ml缓冲液中加入10 μl 试剂D。
充分混匀置冰上备用。
二、 样品处理
1. 收集2-5×106个以上细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 在细胞中加入50 μl冷的裂解缓冲液，高速涡旋振荡15秒。
4. 置冰上持续振荡25-40分钟。
5. 在4℃，10000×g条件下离心10分钟。
6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
三、 对上述处理过的上清进行蛋白定量。
四、 焦亡检测
1、 取40-50 μl大约含100-200 μg蛋白的裂解上清，加入50 μl检测缓冲液。
2、 加入10 μl 焦亡试剂B，充分混匀。在37℃下避光反应1-4小时，有黄色颜色产生即可进行检测。
3、 测定A405 nm或A400 nm。
4、 吸光值与焦亡活性程度成正比。
五、 细胞膜完整性测定
1. 染色工作液的配制：
用纯水将洗涤缓冲液F（10X）10倍稀释（1 ml 试剂F加9 ml纯水充分混匀），充分混匀，配制成洗涤缓冲液工作液（1X）备用。
根据样品数用洗涤缓冲液工作液将焦亡试剂E 100倍稀释，配制成染色工作液。
2. 用洗涤缓冲液工作液洗涤细胞两次。
3. 加适量染色工作液于细胞，室温避光染色5-20分钟。
4. 用荧光设备检测结果。探针的最大激发波长为488 nm，最大发射波长为620 nm。
5. 结果分析 ：
置于荧光设备下检测结果。激发光波长为488 nm，发射光波长620 nm。
正常细胞不能着色，焦亡细胞呈红色荧光。
荧光强度强，焦亡细胞比例高。
常见问题分析
比色法焦亡活性检测方法常见的问题主要为测得的OD值偏低，颜色变化不明显，无法显示与对照组细胞的差异，其可能的原因主要集中在以下几个方面：
1. 样品上样量不够：本方法检测需要的细胞数量须在3×106以上，或者新鲜组织50mg以上，每次反应的蛋白量需要在100ug以上。如果量不够，请增加细胞或组织的量。
2. 样本不新鲜：使用新鲜的细胞或组织样本。
3. 样品裂解不够充分：细胞或组织需要进行充分裂解，最好可以加入适当的蛋白酶抑制剂混合物裂解，裂解后应无明显大量的沉淀，以保证有效获得蛋白。
4. 样品中激活的焦亡水平偏低：首先确认模型的焦亡现象是否明显，以及根据文献和其他验证方法确认该样本是否激活焦亡。
5. 检测时间点的选择是否合适：不论哪种通路的焦亡，需要在焦亡被有效激活并达到相应活化程度后的一定时间范围内检测，过早或过晚均不合适。
6. 不适合本方法检测：某些焦亡诱导剂诱导的焦亡可能是非依赖于该试剂盒检测指标活化的机制，此种情况时利用本试剂盒检测焦亡无明显变化，需要考虑焦亡机制的其他通路。
1. 样品上样量不够：本方法检测需要的细胞数量须在3×106以上，或者新鲜组织50mg以上，每次反应的蛋白量需要在100ug以上。如果量不够，请增加细胞或组织的量。
2. 样本不新鲜：使用新鲜的细胞或组织样本。
3. 样品裂解不够充分：细胞或组织需要进行充分裂解，最好可以加入适当的蛋白酶抑制剂混合物裂解，裂解后应无明显大量的沉淀，以保证有效获得蛋白。
4. 样品中激活的焦亡水平偏低：首先确认模型的焦亡现象是否明显，以及根据文献和其他验证方法确认该样本是否激活焦亡。
5. 检测时间点的选择是否合适：不论哪种通路的焦亡，需要在焦亡被有效激活并达到相应活化程度后的一定时间范围内检测，过早或过晚均不合适。
6. 不适合本方法检测：某些焦亡诱导剂诱导的焦亡可能是非依赖于该试剂盒检测指标活化的机制，此种情况时利用本试剂盒检测焦亡无明显变化，需要考虑焦亡机制的其他通路。
-
优惠促销Promotion
-
轻松下单Order
-
在线留言Online message
-
帮助中心Help center