-20℃ 避光

1.开盖后组份按要求条件保存。
2.拆封后请尽快使用完！

6个月

荧光酶标仪 /荧光光度计 /激光共聚焦显微镜 /流式细胞仪

细胞

荧光酶标仪 /荧光光度计 /激光共聚焦显微镜 /流式细胞仪

1. 荧光酶标仪
2. 荧光光度计
3. 共聚焦显微镜
4. 流式细胞仪
5. 离心机
6. 移液器
7. 冰箱
8. 冰盒

1.PBS
2.PBST
3.纯水

1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套
4. 黑色透明底细胞培养板

1. 预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。
2. 除了目标模型样本，须根据实验需要合理设置阳性对照、阴性对照、空白对照等样本。
3. 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
4. 染色液极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要充分回温溶解混匀，防止在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
5. 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
6. 各换液、洗涤步骤需要避免丢掉状态不好的粘附性降低的细胞、漂浮细胞等。换液须使用培养板离心机操作。没有培养板离心机时，用离心管收集后加回培养孔。

贴壁细胞：
1. 模型制备好以后，吸除培养液。
2. 用预冷的PBS洗1次，离心后移除PBS。
3. 加入PI染色液工作液后于室温避光条件下孵育10分钟。
4. 孵育后，移除PI染色液，立即用预冷的PBS 轻柔快速漂洗 2-3 次，离心后移除PBS。
5. 加入洗涤液A，室温静置孵育10-15分钟。
6. 吸除洗涤液A，用预冷的PBS洗3次，每次3-5分钟。
7. 加入洗涤液B，室温静置避光孵育60分钟。
8. 吸除洗涤液B，加入GSDMD-N荧光抗体， 4ºC孵育过夜或室温孵育2小时以上。
9. 小心吸出GSDMD-N荧光抗体到适当的容器内，4ºC保存，留做下次使用。
10. 用PBST洗3-4次，每次5-10分钟。
11. 加入荧光增强剂，室温避光孵育1小时。
12. 小心吸出荧光增强剂到适当的容器内，4ºC保存，留做下次使用。
13. 用PBST洗3次，每次5-10分钟。
14. 用PBS洗1次。
15. 检测结果。


悬浮细胞：
1. 离心收集细胞，PBS洗1次。吸尽PBS后把细胞适当弹散。
2. 加入PI染色液工作液后于室温避光条件下孵育10分钟。
3. 孵育后，离心移除PI染色液，立即用预冷的PBS 轻柔快速漂洗 2-3 次，离心后移除PBS。
4. 取少许PBS重悬细胞，滴加到盖玻片或载玻片上，做成涂片。充分晾干后继续后续操作。
5. PBS洗2次，每次5分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体，同时要保持样品表面有些湿润，不能干掉，最后一次洗涤完毕时吸尽PBS。
6. 转贴壁细胞步骤五。后续步骤同贴壁细胞步骤五起的步骤。采用滴染的方法，具体注意如下的问题。


结果检测：

荧光显微镜观察：
用荧光显微镜检测结果。最大激发为488 nm，最大发射波长为516 nm和617 nm。


流式细胞仪检测：
染色后尽快用流式细胞仪检测结果。


荧光酶标仪检测：
在微孔板中准备细胞样本孔以及对照孔。
染色后用荧光酶标仪/荧光光度计检测结果。最大激发为488 nm，最大发射波长为516 nm和617 nm。


结果解读
健康活细胞： GSDMD-N 阴性（无绿色荧光），PI 阴性（无红色荧光或极弱）。

早期焦亡细胞： GSDMD-N 阳性（绿色荧光，定位在细胞膜），PI 阴性或弱阳性。

典型焦亡细胞： GSDMD-N 强阳性（绿色荧光，清晰膜定位），PI 强阳性（红色荧光）。

晚期焦亡/继发性坏死细胞： 细胞可能肿胀破裂，形态不完整。GSDMD-N 信号可能弥散或减弱（蛋白降解），PI 强阳性。

凋亡细胞： GSDMD-N 通常阴性。PI 在早期凋亡（膜完整）阴性，晚期凋亡（继发性坏死）阳性。形态学上可能呈现凋亡小体。

原发性坏死细胞： GSDMD-N 阴性，PI 阳性。形态学上可能呈现肿胀溶解。