2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP,co-IP,ELISA,EMSA等

动物细胞/组织

1.使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
2.提取过程简单方便，将蛋白提取的时间缩短至30分钟-1小时。
3.含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
4.紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
5.总蛋白提取液含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。
6.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

WB,IP,co-IP,ELISA,EMSA等

1.离心机
2.振荡器
3.匀浆机/匀浆器
4.涡旋混匀器
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒

1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
蛋白酶抑制剂在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
下游实验如果是进行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性检测，提取液可以不加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，注意提取过程保持低温操作，缩短离心时间。
Western Blot实验内参可以选用beta-actin、GAPDH、Tubulin。
离心机转速有相对离心力（RCF，×g）和每分钟转速（RPM，r/min）两种表示方式，有些离心机设置有RPM和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：g=r×1.118×10-5×rpm2 （r 为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米) 例如: 转速为3000rpm，有效离心半径为10 cm，则相对离心力（RCF，×g）为=10×1.118×10-5×30002=1006.2（×g）。

细胞样本总蛋白提取：
悬浮细胞蛋白提取：
1. 提取液准备：
每500 μl冷的总蛋白提取液中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物和2 μl磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取5×106个细胞，在4℃，2500×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
3. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 每5×106 -1×107个细胞（大约50 mg细胞/50 μl细胞沉淀体积）中加入500 μl冷的总蛋白提取液，吹打混匀后，在4℃条件下振荡20-30分钟，至细胞充分裂解，无明显细胞沉淀。
5. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。
7. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。


贴壁细胞蛋白提取：
1. 提取液准备：
每500 μl冷的总蛋白提取液中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物和2 μl磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 小心吸取贴壁细胞的培养液。
3. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干PBS。
4. 加入适量冷的总蛋白提取液，振荡15-30分钟，至细胞充分裂解，用细胞刮刀刮一遍，将裂解液吸入另一干净离心管。
5. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即得到总蛋白。
7. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。


组织样本总蛋白提取：
1. 提取液准备：
每500 μl冷的总蛋白提取液中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物和2 μl磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取50-100 mg组织样本，用PBS洗干净，然后用手术剪刀尽可能剪碎，加入500 μl总蛋白提取液，用组织匀浆器/匀浆机匀浆至无明显肉眼可见固体。
3. 将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中，在4℃条件下振荡10-20分钟。
4. 在4℃，10000-14000×g条件下离心15分钟。
5. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即得到总蛋白。
6. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

1.蛋白浓度低？
处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。

2.细胞裂解速度慢？
为了充分保证提取得到的蛋白的活性，提取液采用独特的保护蛋白的配方，裂解能力温和，下游应用范围广。适当延长裂解的时间即可。

3.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。

4.提取时出现胶状沉淀？
蛋白提取液处理产物中有时会出现少量透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的特定蛋白的情况下，可以直接离心取上清进行后续实验即可；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理，300w/10秒间隔10秒，超声3分钟，随后离心取上清用于后续实验。检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，不必进行超声处理。

5.提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

1.Keyu Luo et al.
Multiple integrin ligands provide a highly adhesive and osteoinductive surface that improves selective cell retention technology
Acta biomaterialia 2019 （IF=6.638）

2.Chang Yu et al.
Targeted iron nanoparticles with platinum-(IV) prodrugs and anti-EZH2 siRNA show great synergy in combating drug resistance in vitro and in vivo
Biomaterials 2018 （IF=10.317）

3.Bing Li et al.
SWATH label-free proteomics analyses revealed the roles of oxidative stress and antioxidant defensing system in sclerotia formation of Polyporus umbellatus
Sci Rep. 2017 （IF=5.228）

4.Yan Li et al.
Tat PTD-Endostatin-RGD: A novel protein with anti-angiogenesis effect in retina via eye drops
Biochimica et Biophysica Acta 2016 （IF=5.083）

5.Jie Li et al.
Sex hormones regulate cerebral drug metabolism via brain miRNAs: down-regulation of brain CYP2D by androgens reduces the analgesic effects of tramadol
British Journal of Pharmacology 2015 （IF=5.259）

6.Pin Huan et al.
Identification of differentially expressed proteins involved in the early larval development of the Pacific oyster Crassostrea gigas
Journal of Proteomics 2012 （IF=5.074）