细胞周期检测试剂盒-蓝色荧光

BB-41043
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产品概述 product description

贝博® BBcellProbe® 细胞周期检测试剂盒是利用细胞内DNA能够和荧光染料结合的特性,细胞各个时期其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同,流式细胞仪检测的荧光强度也不一样来检测细胞周期。 细胞周期(cell cycle)是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程,通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G1期:细胞开始RNA和蛋白质的合成,但DNA含量仍保持二倍体。S期:DNA开始合成,这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。当DNA复制结束成为4倍体时,细胞进入G2期。G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质,直到进入M期。因此,单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。一旦有丝分裂发生,细胞分裂成两个细胞,这两个细胞或者进入下一个细胞周期,或者进入静止期(G0期),而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此,整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析,可以得到细胞各个时期的分布状态,计算出G0/G1%、S%、G2/M%,了解增殖能力,在肿瘤病理学研究中,通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。 DAPI为插入性核酸荧光染料,能选择性的嵌入核酸DNA双链螺旋的碱基之间与之结合,其结合的量与DNA的含量成正比例关系,用流式细胞仪进行分析,就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态,从而计算出各个期的百分含量。DAPI染色后,假设G0/G1期细胞的荧光强度为1,那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2,正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。 DAPI探针的最大激发波长为358 nm,最大发色波长为461 nm。 除了本试剂盒提供的蓝色荧光细胞周期检测产品,贝博还能提供绿色、红色、橙色、深红色等荧光颜色的细胞周期检测试剂盒产品。 贝博® BBcellProbe® 可以提供各种细胞分析试剂盒。包括细胞凋亡、活性、增殖、毒性、活性氧、周期、细胞代谢、氧化应激、膜流动性、膜电位、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、胞外酸化、细胞内pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种细胞检测试剂盒产品。 贝博® BBcellProbe® 可以为您提供各种细胞成像、细胞示踪与追踪试剂盒产品。包括各种颜色的BBcellProbe® M系列、N系列、L系列、E系列、G系列等细胞膜、细胞质、细胞核、溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体、骨架、微管等细胞、细胞亚结构荧光染色试剂盒产品,以及钙离子、钠离子、氩离子等各种荧光染色试剂盒产品。 贝博® BBcellProbe® 可以提供动物、植物、微生物、酵母、水产、家禽、兽类、土壤等样本的各种生化指标检测的数百种试剂盒产品。 贝博® BBcellProbe® 可以提供各种细胞、组织染色,免疫组织化学,细胞培养等相关试剂盒产品。

保存温度
-20℃避光
注意事项
1.染料-20℃避光保存;
2.Rnase A溶液-20℃保存。
有效期
1年
检测方法
流式细胞仪
适用样本
1.悬浮细胞 2.贴壁细胞
产品应用
流式细胞仪
仪器准备
1.流式细胞仪
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
试剂准备
1.PBS 缓冲液(pH7.4,实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液(1X))
2.或者HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)
耗材准备
1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
使用注意事项
1.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
2.最好使用含EDTA的细胞消化液。
3.洗涤细胞离心转速不可超过800×g。
4.乙醇固定时离心大概采用2000×g力5分钟,离心力太小可能部分细胞难以沉淀。
5.固定时在振荡器上轻轻振荡细胞,并缓慢滴加75%乙醇,直接加入会导致细胞团聚的现象,很难重悬成单细胞。或者先用冷PBS悬浮细胞,充分悬浮,使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇,终浓度为70-90%乙醇。乙醇固定之后须无细胞沉淀。
6.为防止不同批次细胞在实验时本身所出周期不同导致重复性差,可以在实验前进行细胞的同步化处理,减少批间差异。实验细胞应处于对数生长期,不能是完全长满,一般在50~80%比较好。
7.分析的时候需要的是单个的细胞,400目筛网过滤是用来将粘在一起的细胞团滤掉,否则会出现人为的多倍体干扰,不过如果经验丰富的操作人员也可以gate掉。如果没有条件过滤,请在染色之前将细胞弹的很散,再进行染色。
8.本试剂盒也可用于非固定细胞周期检测。
9.组织处理方法:用剪刀将组织剪成小块,用0.25%胰酶消化30min-1h,200-400目筛网过滤细胞,获得单细胞悬液。如组织难以消化,可加入适量胶原酶。


使用方法

1. 每100 μl PBS或HBSS缓冲液中加入10 μl DAPI染液,充分混匀,配制成染色工作液。
2. 收集样本细胞,细胞数量在5-10X106个。
【注】:
 用300-800×g力离心5分钟。
 不同细胞离心力不同,以实验室常用离心力为准。
3. 用冷PBS洗涤细胞两次。
【注】:
 在300-800×g左右,离心5分钟,小心吸取上清,避免吸走细胞。
4. 在15 ml离心管中,用500 μl PBS重悬细胞。
【注】:
 此时要保证是好的单个细胞悬浮液。否则细胞会被成团固定。
5. 滴加2-5 ml冷乙醇4℃固定过夜或-20℃固定1小时。
【注】:
 要非常慢的加乙醇,并轻微振荡防止细胞成团。
 轻轻吹打混匀,避免细胞成团;不能太剧烈,防止细胞损伤成碎片。
 到此步可以存放,-20℃保存样品,1周内样品检测不受影响。
 最长可以存放3周。
6. 取5X106细胞,在15 ml锥形离心管中1000×g离心10分钟,弃上清,收集细胞。
7. 用冷PBS洗涤细胞两次。
【注】:
 乙醇固定的细胞难以沉淀。可以在PBS中添加1%的BSA或小牛血清改善。
 或者稍微加大离心力。
8. 用500 μl冷PBS重悬细胞。
【注】:
 可以用添加1%的BSA或小牛血清的PBS重悬。
9. 加入Rnase A溶液20 μl, 37℃水浴30分钟。
10. 用400目细胞筛网过滤。
【注】:
 无细胞筛网可以不做此步骤。
11. 在1000×g离心10分钟,弃上清,收集细胞。
12. 加入100 μl DAPI染色工作液重悬细胞,轻轻混匀后4℃避光孵育30分钟-1小时。
【注】:
 染色完成后宜在24h内完成流式检测。
13. 加入400 μl PBS或HBSS缓冲液混匀。
14. 流式检测结果。激发波长为358 nm。发射波长461 nm。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

常见问题分析
1.染色后找不到细胞?
固定细胞可能难以离心沉淀;固定细胞可能成团;固定细胞膜容易损伤成碎片。操作过程中注意以上几点。

2.可以不固定细胞吗?
本试剂盒可以用于非固定细胞的周期检测。
参考文献
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